Клинбиз | Клининговая компания в Нижнем Новгороде | Цены на клининговые услуги и уборку

Судебно-автороведческая экспертиза | Стоимость автороведческой экспертизы

Во время определения авторства текста удается выявить ряд нюансов:

1. Уровень образованности автора.
2. Является ли данный язык родным, знает ли автор иностранные языки.
3. Пол, примерный возраст, происхождение.
4. Возможный регион проживания.
5. Вероятная профессия.

Все эти факторы можно определить во время тщательного анализа текста. Можно получить массу полезной информации, которая будет использоваться в дальнейшем. По собранным данным удается выявить вероятного автора текста.

Как проводится криминалистическая автороведческая экспертиза

Данная процедура может выполняться как во время судебного процесса, так и вне его. Отличия в заказчике исследования и в некоторых нюансах. Основные же этапы исследования авторства не меняются, сотрудники всегда придерживаются принципа независимости при работе.

Как проходит стандартное исследование на авторство текста?

1. Если осуществляется судебная автороведческая экспертиза, то инстанция готовит постановление. Для проведения внесудебного исследования в компанию обращается частное или юридическое лицо.
2. Заключается соглашение.
3. Ставятся основные задачи и формируется перечень вопросов.
4. Сотрудникам передаются материалы, которые нуждаются в изучении.
5. Они внимательно анализируют текст, чтобы получить больше информации о человеке, который написал его.
6. Удается определить авторство конкретного лица, если нужно выполнить сравнение.
7. В заключении сотрудники предоставляют всю собранную информацию и отвечают на вопросы.
8. Документы передаются непосредственно заказчику.

Весь процесс занимает не так много времени, как может показаться изначально, благодаря многолетнему опыту специалистов. За счет слаженной работы специалистов и отработанной процедуры, удается существенно ускорить весь процесс в определении авторства. Заключение по поставленным вопросам о тексте Вы сможете получить в самые короткие сроки.

Кто занимается выполнением автороведческой экспертизы?

Экспертиза авторства текста – одно из главных направлений деятельности нашей компании. Фирма имеет богатый опыт проведения автороведческих экспертиз. Просто свяжитесь с сотрудниками, наши специалисты по авторству текста ответят на все ваши вопросы.

Мы давно занимаемся выполнением автороведческой экспертизы. Специалисты смогут собрать максимум информации об авторе и провести сравнение текста.

Основные достоинства нашей экспертной организации:

1. Наши специалисты имеют соответствующее образование и способны справиться с задачами различной сложности.
2. Весь процесс занимает не так много времени. Сотрудники постараются максимально сократить его, чтобы вы быстро получили результаты.
3. Предоставляется официальное заключение, которое составлено с учетом всех правил по утвержденной форме.
4. Вы можете быть уверены в его объективности и точности.
5. Компания предлагает привлекательные цены.
6. Вы останетесь довольны сотрудничеством.

5 / 5 ( 25 голосов )

Автороведческая экспертиза : Top Expert

Автороведческая экспертиза — исследование текста, направленное на установление авторства произведения, отдельных характеристик автора, условий создания произведения, а также выявление признаков авторского произведения в спорном объекте.

Сроки:	7-10 раб дней
Цена	от 10 000 р.
Вы получаете:	Бесплатную консультациюСкидки при заказе более 2-ух объектов исследованияКачественное заключение эксперта

Внимание: сроки и стоимость зависят от сложности объекта,более подробную информацию можно получить у специалистов экспертно-правового центра Топ Эксперт

Виды автороведческих экспертиз:

В каких случаях назначают судебную автороведческую экспертизу?

• В спорных ситуациях, требующих установления авторства текста (анонимные сообщения, фальсификация авторства и т.д.).
• При установлении обстоятельств, связанных с нарушением авторских прав (плагиатом):
• в спорных ситуациях, связанных с объектами авторского права;
• в спорных ситуациях, требующих установления обстоятельств выполнения письменного текста.

Объекты автороведческого исследования:

• Письменные речевые произведения: письма, официальные документы, литературные и публицистические тексты, Интернет-сообщения и т.д.
• Произведения искусства: архитектурные, скульптурные, изобразительные, музыкальные и другие
• Фотографии, планы, схемы, эскизы
• Издательскую продукцию

Вопросы идентификационного характера:

• Является ли автором представленных на исследование текстов (произведений) одно и то же лицо?
• Является ли автором текста (произведения) лицо (ФИО), образцы письменной речи (произведений) которого представлены на исследование?

Вопросы диагностического характера:

• Каков пол и примерный возраст автора?
• Какова профессия или род занятий автора документа?
• Является ли русский язык родным для автора текста?
• Написан ли данный текст лицом, обладающим навыками научного (публицистического, официально-делового) стиля речи?

В спорных ситуациях, требующих установления обстоятельств выполнения письменного текста:

• Составлен ли текст с намеренным искажением письменной речи?
• Являются ли автор и исполнитель рукописного текста одним и тем же лицом?
• В каком состоянии находился автор исследуемого текста во время составления последнего: в обычном или необычном физиологическом состоянии (состоянии алкогольного либо наркотического опьянения, стресса, физической усталости, болезненном состоянии и т. д.)?

При установлении обстоятельств, связанных с нарушением авторских прав (плагиатом):

• Является ли произведение «…» самобытным и оригинальным или переработанным вариантом другого произведения?
• Имеются ли дословные текстовые совпадения в произведениях «…» и «…»?
• Имеется ли полное или частичное сходство, тождество или различие произведений «…» и «…»?
• Оригинален ли словесный компонент, словосочетание, элемент произведения (название, имя персонажа и т.д.)?
• Имеются ли в текстах «…» и «…» совпадающие индивидуально-авторские речевые особенности?
• Написан ли текст «…» или его отдельные фрагменты одним и тем же лицом?

В спорных ситуациях, связанных с объектами авторского права:

• Является ли спорный объект, представленный на исследование, авторским произведением?
• Обладает ли произведение признаками оригинальности, новизны и творческого характера?
• Является ли произведение составным? Оригинально ли произведение по подбору материала и его расположению?

С постоянным увеличением числа пользователей Интернета информация стала доступной для человека, в связи с этим возросло и количество заимствований, плагиата. Современные цифровые технологии позволяют обрабатывать текст различными способами. В таком случае тоже возникает необходимость в проведении автороведческой экспертизы. Специалист выясняет:

• Является ли представленный для анализа текст заимствованием?
• Какова степень заимствования текста из произведения возможного автора?

Чтобы получить достоверный результат в ходе автороведческой экспертизы, необходимо предоставить несколько образцов текста, поскольку по одному судить об авторской манере необычайно сложно. Объем образца должен составлять не менее 500-600 слов. Также важно, чтобы образцы были написаны в одном жанре или относились к одному стилю речи. Наиболее сложными для экспертизы являются тексты, написанные на бланках и с соблюдением норм делопроизводства, поскольку они относятся к формализованным текстам. Необходимо помнить, что в некоторых случаях эксперт-авторовед способен дать однозначный ответ на поставленные вопросы, а иногда заключение носит вероятностный характер.

Уточняйте интересующий Вас вопрос по контактному телефону:

+7 (495) 127-09-35
+7 (916) 435-72-27

Консультация специалиста в офисе рядом с м. Охотный ряд осуществляется по предварительной записи с целью выбора наиболее удобного времени для Вас!

С Уважением,
Коллектив ЭКСПЕРТНО-ПРАВОВОГО ЦЕНТРА «TOP EXPERT».

Загрузка…

Автороведческая экспертиза

АНО «Центральное Бюро Независимых Судебных Экспертиз» проводит автороведческие

 экспертизы (исследования) как в судебном, так и в досудебном (внесудебном) порядке; по письменному поручению органов государственной власти (судов, прокуратур, Следственного комитета и пр.), и по договорам с физическими лицами.

Консультация специалиста и предварительное исследование (экспертиза) – БЕСПЛАТНО!!!

Автороведческая экспертиза – это вид речеведческой экспертизы, целью которой является установление авторства текстового документа. Объектом автороведческой экспертизы могут являться как машинописные печатные документы, так и рукописные фрагменты документов.

Автороведческая экспертиза проводится в случае нарушения авторских прав, когда необходимо определить автора исследуемого произведения. Этот вид экспертизы широко применяется также в криминалистике и судебной практике, при рассмотрении различных уголовных и гражданских дел.

В результате проведения автороведческой экспертизы можно определить многие параметры письменной речи автора — уровень его образования, уровень владения языком, принадлежность автора к той или иной социальной группе, особенности эмоционального состояния автора при написании текста, особенности его мышления и многое другое.

Автороведческая экспертиза проводится путем анализа и сопоставления особенностей письменной речи, отобразившихся в конкретном текстовом документе. Данный вид экспертизы проводится по определенным методам, позволяющим произвести комплексный анализ текста на нескольких уровнях. Существует несколько методов анализа текста – орфографический, пунктуационный, синтаксический, лексико-фразеологический и стилистический. Каждый из этих методов выявляет особенности написания текста и позволяет с максимальной точностью идентифицировать автора.

Пунктуационный метод анализа текста устанавливает особенности употребления знаков препинания и выявляет характерные ошибки. Орфографический метод проведения автороведческой экспертизы устанавливает характерные грамматические ошибки автора.

С помощью этих методов исследования можно определить уровень образования предполагаемого автора текста.

Синтаксические и лексико-фразеологические методы учитывают особенности составления предложений, употребление характерных оборотов речи, выбор редких, иностранных слов и неологизмов, порядок употребления слов в речевых конструкциях и многое другое. Синтаксические и лексико-фразеологические параметры письменной речи в определенной степени являются индивидуальными, поэтому позволяют с максимальной точностью установить автора исследуемого документа.

При стилистическом методе исследования учитывается жанр и структура текста, используемые изобразительные средства и характерные стилистические фигуры.

При проведении автороведческой экспертизы большое значение имеют объём и качество сравнительного материала. Для сравнения необходимо иметь достоверные образцы текстов, автором которых несомненно является конкретное лицо.

Автороведческая экспертиза проводится специалистами — филологами, имеющими достаточный уровень и опыт работы в области проведения экспертиз по установлению авторства.

Судебная автороведческая экспертиза текста с целью установления пола его автора: проблемы и перспективы

УДК 343.982.323

Страницы в журнале: 111-115 

 

Т.А. Литвинова,

кандидат филологических наук, НИЦ «Курчатовский институт» Россия, Москва [email protected]

 

Установление пола автора анонимного и псевдоанонимного письменного текста является одной из магистральных и в то же время самых сложных задач судебного автороведения. Рассматриваются основные проблемы, с которыми сталкиваются эксперты-автороведы при анализе текста с целью диагностирования пола его автора, и предлагаются возможные пути их решения.

Ключевые слова: судебная экспертиза, автороведческая экспертиза, установление половой принадлежности автора текста, корпус текстов, стилеметрия.

 

Введение. Судебная автороведческая экспертиза (САЭ) относится к классу криминалистических экспертиз [12] и служит для решения целого ряда идентификационных и диагностических задач. Идентификационная САЭ отвечает на вопросы относительно авторства текста (является ли N автором спорного текста?). Предмет судебно-автороведческой диагностической экспертизы — «фактические данные об авторе документа и условиях его составления, которые устанавливаются экспертом-криминалистом на основе специальных познаний при исследовании документа и иных материалов уголовного или гражданского дела» [11, с. 51]. К таким данным относятся пол, возраст, психологические особенности автора текста, уровень образования, состояние автора в момент написания текста.

Несмотря на то что в последнее время наблюдается рост количества автороведческих экспертиз, поскольку «в российских судах рассматривается значительное количество дел, в которых тексты являются важным источником доказательств, необходимых при расследовании преступлений и разрешении гражданских споров» [2, с. 755], проблема комплексного автороведческого исследования на основе применения специальных знаний относится к числу малоизученных.

Установление пола автора письменного текста c использованием специальных лингвистических знаний является одной из магистральных задач судебного автороведения [15], однако общепринятой методики установления пола автора текста на русском языке с учетом возможного искажения и имитации признаков письменной речи до настоящего времени выработано не было.

Целью настоящего исследования является анализ существующих методов и подходов к проведению САЭ при диагностировании пола автора текста на основе специальных лингвистических знаний, а также выявление проблемных зон и возможных путей модернизации существующих подходов.

Анализ экспертной практики, научной и методической литературы позволил выявить следующие проблемы в области САЭ с целью диагностирования пола автора письменного текста на русском языке.

1. Описательный характер исследований. Проблемой выявления различий в русской устной и письменной речи мужчин и женщин занимаются отечественные ученые-криминалисты и лингвисты на протяжении нескольких десятилетий (работы С.М. Вула, Е.И. Горошко, А.В. Кириллиной и других ученых, см. обзор в работе [9]). В результате подобных исследований был выявлен целый ряд различий между мужским и женским стилем письма, однако было установлено, что подобные различия являются количественными: не существует языковых элементов, характерных только для мужчин или женщин, но есть гендерно обусловленные различия, в частности использования в речи тех или иных элементов.

Как справедливо отмечает Е.И. Ермолова, в большинстве источников, посвященных автороведческому исследованию текста с целью диагностирования пола его автора, указываются только отдельные, не связанные между собой признаки письменной речи мужчин и женщин, а также признаки письменной речи, характерные для лиц того или иного пола, которые носят явный характер (например, эмоциональность суждений, бытовая тематика, образная лексика — для письменной речи женщин; лаконичность высказываний, бранная лексика — для мужчин) [3]. Кроме того, отсутствуют масштабные корпусные исследования гендерно обусловленных различий, которые, как указывается, необходимы для построения надежных автороведческих методик [1].

В 2007 году Экспертно-криминалистическим центром МВД России были изданы методические рекомендации «Комплексная методика производства автороведческих экспертиз» (далее — Методические рекомендации) [4], в которых был приведен составленный на основе анализа научной литературы, экспертной практики и собственных исследований авторов список характерных признаков письменной речи мужчин и женщин, на основании которых, как утверждается, можно решить вопрос о половой принадлежности автора анонимного документа в рамках диагностической автороведческой экспертизы. Однако сама методика диагностирования пола автора текста, основанная на использовании математических методов анализа данных, отсутствует.

Между тем применение математических методов анализа особенно важно вследствие того, что, как было указано выше, все различия между мужской и женской письменной речью носят не инвентарный, а вероятностный характер. При этом в большинстве проанализированных нами научных работ и экспертных заключений вместо методов математической статистики используются простейшие арифметические подсчеты, что приводит к неоднозначности выводов.

Проблема построения математических моделей для диагностирования пола автора текста на русском языке ставилась в ряде работ [6; 7; 10; 14]. Были построены математические модели, определяющие пол автора текста с точностью 60—70%. Однако, несмотря на перспективность подобных исследований, на материале русского языка они по-прежнему единичны.

В зарубежной науке подход, связанный с использованием обширного корпусного материала и применением современных методов математической статистики с целью построения классификаторов (математических моделей), позволяющих с той или иной степенью вероятности диагностировать пол автора анонимного текста, в том числе короткого, функционирующего в сфере интернет-коммуникации, развивается на протяжении последнего десятилетия.

2. Проблема выбора параметров текста для анализа. Несмотря на то что исследователи анализировали разные языковые уровни с целью выявления различий в речи мужчин и женщин, проблема выбора параметров текста для анализа остается нерешенной.

Чтобы экспертное заключение о вероятном поле автора письменного текста было как можно более объективным, необходимо анализировать текст по таким языковым параметрам, которые являются квантифицируемыми. Желательно, чтобы подсчет численных значений большей части выбранных для исследования параметров мог быть автоматизирован и осуществлен при помощи современных средств автоматической обработки текстов. Это позволит снизить уровень субъективности выводов эксперта.

В экспертной практике часто встречается ситуация, в которой образцы для сравнительного исследования и спорные тексты относятся к разным жанрам, поэтому необходимо анализировать прежде всего те параметры текста, количественные значения которых являются относительно стабильными в текстах одного автора. На данный момент вопрос о составе таких параметров является открытым [5].

Многие исследователи, занимающиеся указанной проблемой (в том числе составители Методических рекомендаций), при описании особенностей мужской и женской речи упу-скают из виду возможность сознательного искажения признаков текста с целью имитации речи лица противоположного пола.

Следует признать, что в российской науке проблеме маскировки признаков письменной речи в целом и проблеме сознательного изменения признаков письменной речи с целью имитации речи лица противоположного пола в частности уделяется мало внимания, несмотря на их очевидную теоретическую и практическую значимость.

В трудах Т.В. Гомон, В.Ф. Енгалычева, Е.И. Горошко, В.П. Белянина, Е.С. Константиновой, Е.С. Ощепковой (см. подробный обзор в работе [9]) были предприняты попытки составления списка параметров текста, легко поддающихся имитации, и тех, которые поддаются имитации гораздо сложнее. Исследователи, анализирующие тексты с намеренным искажением признаков письменной речи, делают вывод, что существуют параметры текста, которые поддаются имитации, и такие, которые не изменяются даже при намеренном искажении признаков письменной речи. Однако единства мнений по вопросу о составе таких параметров среди ученых нет. Очевидно, что для решения этого вопроса необходимы дополнительные исследования на обширном корпусном материале.

3. Проблема объема текста для анализа. Методология автороведческой экспертизы текстов на русском языке разрабатывалась преимущественно на материале художественных текстов и малоприменима к текстам небольшого объема, которые нередко становятся объектом автороведческой экспертизы. В ряде работ, в частности в Методических рекомендациях, указывается, что в современной экспертной практике особенно актуальны (в том числе в связи с бурным развитием интернет-коммуникации) проблемы анализа короткого текста (до 500 слов), при этом объем текста в 100 словоформ в рекомендациях назван как минимальный, пригодный для проведения диагностической автороведческой экспертизы, в том числе для определения пола автора текста.

4. Недостаточный учет влияния других личностных характеристик на отражение пола в речи. По современным  представлениям половая дифференциация в речи — это результат комплексного влияния биологических, психологических и социальных факторов. Очевидно, что без учета указанных факторов невозможно построение надежных методик диагностирования пола автора текста, применимых на практике.

Современная судебно-автороведческая экспертиза, как и другие виды экспертиз, должна соответствовать принципу научной обоснованности. Особенно это касается требования адекватно применять в экспертном исследовании новейшие достижения научного знания [13]. В настоящее время множество научных групп в разных странах мира работают над решением проблемы диагностирования характеристик (пола, возраста, уровня образования, родного языка, психологических характеристик и т. д.) автора текста, в том числе участника интернет-коммуникации, на основе количественного анализа языковых параметров текстов путем создания оптимизированных математических моделей, однако на материале русского языка указанная проблема, как уже отмечалась,  практически не разработана.

Исследования, направленные на построение методик диагностирования пола автора письменного текста на русском языке с учетом потребностей экспертной практики и использующие современные средства математического анализа данных, проводятся в ходе междисциплинарного проекта, выполняемого коллективом Лаборатории моделирования личности по тексту при Воронежском государственном педагогическом университете и сотрудниками НИЦ «Курчатовский институт». Сформирована совместная программа исследований, направленных на объективизацию, оптимизацию и автоматизацию методик автороведческой экспертизы текста с целью диагностирования пола его автора. Работы проводятся на материале специально созданного для автороведческих исследований корпуса текстов RusPersonality, снабженного метаразметкой в виде информации об авторах [8]. Планируется использование корпусов текстов, составленных при помощи специальных программных средств на основе русскоязычных текстов интернет-коммуникации (Twitter, Facebook) и данных об их авторах (пол) из персональных профилей, а также экспериментальных корпусов текстов, составленных без искажения признаков письменной речи, и текстов тех же авторов, в которых они имитируют речь лиц противоположного пола и другой возрастной группы (Personality Imitation Corpus).

Средний объем текстов корпуса RusPersonality составляет 230 слов, при этом минимальный объем текста для включения в корпус — 100 слов. Таким образом, тексты корпуса являются пригодными для разработки и апробации методик диагностирования пола автора короткого текста на русском языке. Заметим, что минимальный объем текста для диагностирования пола и возраста его автора с той или иной степенью вероятности будет определен в ходе экспериментальных исследований.  Кроме того, темы текстов Personality Imitation Corpus также будут подбираться с учетом потребностей реальной экспертной практики (письмо несовершеннолетнему лицу с просьбой о встрече; анонимный донос на преподавателя; письмо-угроза официальному лицу и т. д.).

При выборе параметров текстов для анализа будут учтены достижения отечественных и зарубежных лингвистов, психологов, криминалистов, специалистов по информационным технологиям, а также результаты, полученные ранее авторским коллективом. Будут использованы только те параметры текста, которые поддаются объективной квантификации, являются стабильными в текстах одного автора, не зависящими от темы и жанра и не подверженными сознательному искажению. Такие параметры будут выявлены в ходе специального исследования.

Для лингвистической разметки в зависимости от вида параметров будут применяться средства автоматической обработки текста, в том числе разработанные авторским коллективом средства для морфологической и синтаксической разметки текста. Коллективом была разработана программа для лингвостатистического анализа текста по целому ряду параметров, которые часто используются в современных работах по психолингвистике, автороведению, лингвоперсонологии, психиатрической лингвистике, идиостилистике и т. д. (средняя длина слова, средняя длина предложения, доля в тексте слов той или иной части речи, частотность того или иного знака препинания, индексы лексического разнообразия, доля н-грамм частей речи и т.д.).

В ходе исследования будут использованы различные математические подходы к решению поставленной научной задачи, применяющиеся в современных работах (диагностирование характеристик автора как задача классификации текста, решаемая с использованием методов машинного обучения либо регрессионного анализа), и оценена их эффективность для диагностирования пола автора текста.

Безусловно, изучение как письменной, так и устной речи в целях установления половой принадлежности автора представляет сверхсложную задачу, однако использование современных методов компьютерной лингвистики, корпусной лингвистики, математической статистики, опора на существующие достижения общей лингвистики, лингвоперсонологии, нейролингвистики, психолингвистики, когнитивной лингвистики и применение современных методов математического анализа, представляется, будет способствовать созданию более объективных автороведческих методик, в том числе методик диагностирования пола автора текста.

 

Список литературы

 

1. Баранов А.Н. Лингвистическая экспертиза текста: теория и практика. М., 2007.

2. Галяшина Е.И., Приводнова Е.В. Авторове-дческая экспертиза в российском судопроизводстве // Lex Russica. 2006. Т. LXV. № 4. С. 755—761.

3. Ермолова Е.И. Проблема определения пола и возраста автора анонимного документа по признакам письменной речи // Эксперт-криминалист. 2008. № 4. С. 16—18.

4. Комплексная методика производства автороведческих экспертиз: методические рекомендации. М., 2007.

5. Литвинова Т.А. К проблеме стабильности характеристик идиостиля // Известия Южного федерального университета. Филологические науки. 2015. № 3. С. 98—106.

6. Литвинова Т.А. Профилирование автора письменного текста // Язык и культура. 2013. № 3 (23). С. 64—72.

7. Литвинова Т.А. Формально-грамматические корреляты личностных особенностей автора письменного текста // Филологические науки. Вопросы теории и практики.  2013. № 12 (30). Ч. 1.  С. 132—135.

8. Литвинова Т.А., Диброва Е.В., Литвинова О.А., Рыжкова Е.С. Корпусные исследования письменной речи в решении задач судебного автороведения // Филологические науки. Вопросы теории и практики. 2015. № 8. Ч. 1. С. 107—113.

9. Литвинова Т.А., Литвинова О.А. Идентификация и диагностирование личности автора письменного текста. Воронеж, 2015.

10. Литвинова Т.А., Литвинова О.А., Середин П.В. Частоты встречаемости последовательностей частей речи в тексте и психофизиологические характеристики его автора: корпусное исследование // Вестник Иркутского государственного лингвистического университета. 2014. № 2. С. 8—12.

11. Назначение и производство судебных экспертиз: пособие для следователей, судей и экспертов / Л.М. Авилина, Л.Д. Беляева, М.С. Брайнин и др.; отв. ред. Г.П. Аринушкин, А.Р. Шляхов. М., 1988.

12. Николаева Ю.А. К спорам о месте судебной автороведческой экспертизы в классификации криминалистических экспертиз // Юрислингвистика. 2007. № 8. С. 378—382.

13. Радбиль Т.Б., Юматов В.А. Язык и метод в современной судебной экспертизе / под ред. А.Ю. Арефьева. М., 2015.

14. Резанова З.И., Романов А.С., Мещеряков Р.В. Задачи авторской атрибуции текста в аспекте гендерной принадлежности (к проблеме междисциплинарного взаимодействия лингвистики и информатики) // Вестник Томского государственного университета. Филология. 2013. № 6 (26). С. 38—52.

15. Рекомендации Международной научно-практической конференции «Теория и практика судебной экспертизы и криминалистики». Харьков, 2002.

 

Пример заключения Пожарной экспертиза автомобиля

Специалист: П.Ю.

В распоряжение специалиста представлено:

– Копии: заключение Центра судебных экспертиз Южного округа No 440/16 от 06 июля 2016 года.
– Постановление о возбуждении  уголовного  дела  от 1 июля 2015 года, постановление о прекращении уголовного дела  от 30 декабря 2015 года, исковое заявление в Ростовский городской суд.

Целью рецензирования является:

Выяснить, насколько велика вероятность соответствия выводов, сделанных в вышеуказанном заключении, фактическим обстоятельствам происшествия, а также оценить их обоснованность с процессуальной и научно-технической точки зрения.

Заключение Центра судебных экспертиз Южного округа No 440/16 от 06 июля 2016 года была выполнено на основании определения Ростовского городского суда Ростовской области, в котором  эксперту поставлены вопросы:

Определить очаг пожара в автомобиле «Volkswagen Polo», идентификационный номер ———?
Установить причину  возгорания автомобиля «Volkswagen Polo» идентификационный номер ———?

Результаты исследования:

По первому вопросу:

Место первоначального горения, в автомобиле «Volkswagen Polo», располагалось снаружи автомобиля на грунте под левой задней его частью, под местом расположения топливного бака.
По второму вопросу:
Причиной пожара в автомобиле «Volkswagen Polo», идентификационный номер ——— послужило внесение на опорную поверхность автомобиля под топливный бак с левой его стороны интенсификатора горения,  вероятнее всего горючей жидкости с последующим внесением в место разлива источника открытого огня.

Производство экспертизы было поручено К.А., не имеющего даже базового (пожарно-технического) высшего образования, не соответствует ст. 13 Федерального закона РФ No 73-ФЗ. Руководствуясь требованиями законодательства, К.А. не вправе был выполнять порученные ему судебную экспертизу.

Ознакомление с текстом заключения показало, что структура заключения в целом соответствует общепринятым методическим требованиям и состоит из вводной, исследовательской частей и выводов. Однако на этом перечень достоинств заканчивается.

Из текста заключения видно, что ранее по данному делу, сотрудниками Экспертно-криминалистического центра Главного управления МВД России по Ростовской области М.В. и Б.Н. была выполнена комиссионная пожарно-техническая экспертиза No 27/5290 от 12.10.2015г., выводы которой  противоречат  рецензируемому заключению  ЦСЭ ЮО.

No 436/16 от 06.06.2016г. (стр.3). Однако, по какой причине возникло  разногласие, эксперт ЦСЭ ЮО К.А. не объясняет.

В заключении зафиксировано: «Осмотр объекта исследования проводился в сравнении с автомобилем аналогом, предоставленного сервисным центром ООО «Хейдон-Юг» с целью установления деталей уничтоженных огнем и состояния автомобиля до возникновения пожара» (стр.2). С каким именно ТС «Volkswagen  Polo» осуществлялось сравнение и конкретно, какие поврежденные пожаром детали, механизмы сравнивались, не поясняется. Из этого следует, что эксперт К.А. совместно с заинтересованными лицами (ответчиками) ООО «Хейдон-Юг» в исходе дела, собирал материалы для судебной экспертизы.
Такие следственные действия эксперта К.А. противоречат требованиям ч.2 ст. 16, 19, 24 и 85 Гражданского процессуального кодекса РФ.

В заключении совершенно отсутствует научно-исследовательский процесс. Эксперт в основном строить обоснования на свидетельских показаниях  и  выводах  ранее  выполненных  заключений. Такой исследовательский подход противоречит требованиям существующих методик. Во избежание  получения ошибочного результата исследования эксперт не может принимать в качестве  исходных данных  результаты ранее проведенных аналогичных исследований, а также свидетельские объяснения, особенно, если  встречаются  разногласия  в их показаниях.

Помимо этого не исключается возможность того, что свидетельские показания  в процессе разбирательства дела могут быть признаны ложными или ошибочными.
Поэтому эксперт свидетельские показания, объяснения и результаты аналогичных исследований по данному факту в своем заключении может лишь подтвердить (опровергнуть) или проанализировать предложенные версии в области своей компетенции.

В рассматриваемом случае, эксперту необходимо было бы особое внимание обратить на техническое состояние автомобиля «Volkswagen Polo»,  приобретенного в автосалоне ООО «Хейдон-Юг»,  который по вине производителя постоянно ломался.

Из сказанного следует, что автомобиль «Volkswagen Polo» был продан гр. К.К. с различными срытыми производственными дефектами, которые и могли послужить причиной его возгорания.

К сожалению, автору заключения не удалось установить в каком состоянии находилась бортовая  электросистема.

Такой подход к исследовательскому процессу вызывает только удивление. Если бы в рассматриваемом случае, источником зажигания легковоспламеняющейся жидкости (ЛВЖ) послужило открытое пламя спички, зажигалки или т.п. по мощности, то лицо, подносившее источник зажигая, неизбежно пострадало бы от термических ожогов.

Автор рецензируемого заключения не учел, что горение ЛВЖ происходит в газовой фазе и протекает как диффузный процесс. Над поверхностью жидкости вследствие испарения образуется паровое облако, которое смешиваясь с кислородом воздуха, обеспечивает формирование взрывопожароопасной зоны. Стехиометрическая смесь при воздействии источника зажигания, сгорает мгновенно, в виде объемного взрыва. Также необходимо отметить, что автомобильные пластиковые бензобаки изготовляются из негорючего высокопрочного  материала, а прилитая жидкость на землю не остается на поверхности, она впитывается в грунт.

Таким образом, общий анализ заключения показал, что эксперт ЦСЭ ЮО К.А. имеет очень слабую профессиональную подготовку, совершенно не ориентируется в закономерностях следообразования на объекте пожара, не умеет работать с представленными материалами дела и надлежащим образом с имеющейся нормативно-методической литературой.

Заключение выполнено не в полном объеме, не до конца отработана версия причастности технического состояния автомобиля «Volkswagen Polo» к возникновению загорания. Поэтому причина возникновения пожара сформулирована примитивно, голословно,  в вероятной форме.

Вероятная форма выводов свидетельствует о неуверенности эксперта в результатах проведенных им исследований, что ведет к дезавуированию доказательственной значимости экспертизы.

Согласно существующим требованиям ст. 67 ГПК РФ, данное заключение не может служить доказательством по делу.

Выводы

Ознакомление с текстом заключения Центра судебных экспертиз Южного округа (ЦСЭ ЮО) No 440/16 от 06 электросистема ТС: «По конструкции автомобиля, в задней части под его днищем, на верхней части топливного бака находится электропроводка, ведущая к клеммам топливного насоса расположенного в топливном баке».

«При осмотре автомобиля, топливного насоса и его электрооборудование в зоне очага пожара обнаружено не было, которые вероятнее всего были уничтожены огнем в результате пожара, в связи с че, установить, имелись ли в электрооборудовании топливного насоса признаки аварийных режимом работы не представляется июля 2016 года показало, что оно выполнено на низком профессиональном уровне и не соответствует нормативно-методическим требованиям, регламентирующим производство данного вида экспертиз и исследований и существующему процессуальному законодательству.

Заключение выполнено небрежно, результаты исследований по причине возникновения пожара в автомобиле «Volkswagen Polo», г.р.з. ——— не соответствуют действительным событиям происшествия.

По сформулированным выводам в заключении эксперта нельзя принять обоснованного юридического решения.

Автороведческая экспертиза — Кузбасский институт судебных экспертиз

АВТОРОВЕДЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА

Судебная автороведческая экспертиза (САЭ) – исследование текста (чаще всего печатного) с целью установления авторства (атрибуция произведения) или получения каких-либо сведений об авторе и условиях создания текстового документа.

Предметом САЭ являются фактические данные об авторе текста (его речевые навыки, пол, примерный возраст, профессия и пр.), условиях выполнения текста, устанавливаемые на основе специальных познаний в области фундаментальной (лексикология, морфология, синтаксис, стилистика) и прикладной (текстология, статистическая обработка текста и т.д.) лингвистики.

Объектом САЭ является письменная речь автора (составителя) текста. В более широком смысле объектом признаются тексты документов. В качестве текста могут выступать, по отдельности либо в совокупности, различные записи (например, дневниковые), письма, официальные документы, литературные произведения, тексты публичных выступлений и так далее. В отличие от почерковедческой (графической) экспертизы, где исследуется графическое исполнение текста, в данном случае анализируются его лингвистические особенности.

К услугам экспертов-автороведов прибегают в случаях, когда требуется установить автора анонимного письма, содержащего угрозы в адрес конкретного человека, или установить факт написания текста одним или разными авторами, определить условия выполнения текста. Данный вид экспертизы проводится в рамках расследования уголовных дел о клевете, нарушении авторства (плагиата), при рассмотрении гражданских исков по возмещению причиненного морального и материального ущерба в результате плагиата и пр., а также в процессе решения иных задач: установление принадлежности литературных произведений конкретным авторам, установление принадлежности переписки конкретным историческим личностям и пр.

Задачи САЭ традиционно подразделяются на:

Диагностические (установление фактических данных об авторе текста):

— определение личностных характеристик автора, таких как:

образовательный уровень,

родной язык, знание иностранных языков,

происхождение, место постоянного проживания,

область деятельности, профессия, хобби,

пол, возраст, социальное положение, национальность и прочие социальные характеристики,

наличие навыков определённого стиля письменной речи;

— определение факта сознательного искажения письменной речи.

Идентификационные (установление или проверка авторства):

— подтверждение авторства определённого лица;

— исключение авторства определённого лица;

— проверка того, что автором всего текста был один и тот же человек;

—  проверка того, что написавший текст является при этом его настоящим автором.

Идентификационные задачи автороведческой экспертизы решаются в тех случаях, когда требуется подтвердить или опровергнуть авторство определённого лица (лиц) по отношению к тому или иному тексту, причём предполагаемый автор текста известен и непосредственно доступен. Наиболее очевидные примеры — доказательство или опровержение факта литературного плагиата и доказательство авторства в делах, связанных с правами на литературные произведения. В таких случаях экспертиза заключается в сопоставлении проверяемого текста с текстами, бесспорным автором которых является проверяемое лицо.

Диагностические задачи САЭ решает в тех случаях, когда необходимо установить личность автора какого-либо текста, например, определить автора анонимного письма или подложного документа. В этих случаях сопоставить исследуемый текст с другими текстами автора, как правило, невозможно, и экспертиза заключается в определении (на основании анализа текста) личностных характеристик автора, знание которых позволит выявить ограниченный круг лиц, подлежащих проверке уже другими методами. После установления личности подозреваемого в написании данного текста возможно решение уже идентификационной задачи – подтверждение или опровержение его авторства. 

Решаются и более специфические задачи, в частности, определение психического состояния автора в момент создания текста, выявление факта написания текста в необычных условиях, поиск текстов, написанных под диктовку другого человека.

В процессе проведения САЭ решаются следующие группы вопросов:

Диагностические вопросы:

1. Каков пол автора текста?

2. Каков примерный возраст автора текста?

3. Каков уровень образования автора текста?

4. Какова профессия автора текста?

5. В каких условиях составлен текст?

Идентификационные вопросы:

1. Является ли автором текста N?

2. Является ли автором текста нескольких документов одно и то же лицо?

3. Являются ли авторами фрагментов одного текста разные лица?

В целом САЭ базируется на представлении, что для каждого человека характерен уникальный комплекс особенностей речевого поведения, который может быть использован для идентификации и диагностики. Вся совокупность методов экспертизы направлена на выделение этих особенностей, их описание и сравнение.

Методы автороведческой экспертизы позволяют исследовать текст на пяти уровнях: пунктуационном, орфографическом, синтаксическом, лексико-фразеологическом, стилистическом.

Пунктуационный — особенности употребления автором знаков препинания, характерные ошибки.

Орфографический — характерные ошибки в написании слов.

Синтаксический — особенности построения предложений, предпочтение тех или иных языковых конструкций, употребление времён, активного или пассивного залога, порядок слов, характерные синтаксические ошибки.

Лексико-фразеологический – словарный запас автора, особенности использования слов и выражений, склонность к употреблению редких и иностранных слов, диалектизмов, архаизмов, неологизмов, профессионализмов, арготизмов и так далее. Сюда же относятся навыки употребления фразеологизмов, пословиц, поговорок, «крылатых выражений».

Стилистический – жанр, общая структура текста, для литературных произведений – сюжет, характерные изобразительные средства (метафора, ирония, аллегория, гипербола, сравнение), стилистические фигуры (градация, антитеза, риторический вопрос и так далее), другие характерные речевые приёмы.

Исследования текста на пунктуационном и орфографическом уровне может характеризовать общий уровень грамотности автора, в некоторых случаях – определить, что текст написан автором на неродном языке (когда ошибки орфографии и пунктуации однозначно указывают на смешение языка текста с другим определённым языком). Однако так могут исследоваться лишь тексты, которые не подвергались профессиональной редакторской правке и были исполнены непосредственно автором. Это лично автором написанные письма, записки, документы. Остальные тексты (отредактированные статьи и другие литературные произведения, деловые письма, которые печатались машинисткой под диктовку автора) своими пунктуационными и орфографическими особенностями характеризуют уже не автора, а исполнителя или редактора.

Синтаксический, лексико-фразеологический и стилистический уровень, напротив, не искажаются при мелкой редактуре. Они образуют в совокупности то, что обычно и называется «стилем автора». Именно их анализ представляет наибольший интерес и наибольшую сложность. Существует достаточно много методов анализа стиля. В целом можно разделить их на две большие группы – экспертные и формальные.

Экспертные методы предполагают исследование текста профессиональным лингвистом-экспертом, который выделит характерные особенности проверяемого текста и текстов, написанных предполагаемым автором (если они доступны), и на основании их изучения вынесет свое заключение.

Формальные методы основаны на сравнении вычислимых характеристик текстов. В общем случае текст отображается в вектор вычисленных для него параметров, каждый из которых объективно характеризует некоторый набор особенностей текста. Таким образом, текст графически отображается в некоторую точку n-мерного пространства. При такой формализации автор также может быть представлен в виде аналогичного вектора параметров этим вектором будет вектор текстов, написанных данным автором.

Необходимо иметь ввиду, что решение вопроса об авторстве текста возможно, если исследуемый текст содержит не менее 500 слов!

Виды судебных экспертиз в гражданском судопроизводстве

Консультации, разъяснение судебной практики и представление интересов в суде по тел. 8(926)860-62-79

Уважаемый клиент!

Фактически при осуществлении всех видов судопроизводства, предусмотренных Конституцией РФ (ст. 118), возникает необходимость в рассмотрении различных вопросов, требующих специальных знаний в различных областях науки, техники, искусства, ремесла и, следовательно, назначении экспертизы.

Судебная экспертиза — один из институтов доказательственного права, через призму которого можно проследить многие закономерности современного развития гражданского процессуального права в целом.

Основная цель гражданского процесса — защита прав и охраняемых законом интересов граждан и юридических лиц. Исходя из принципов диспозитивности, в особенности состязательности сторон ведет к тому, что сами заинтересованные лица должны заботиться о доказательственном материале. От использования экспертизы во многом зависит исход процесса. На сегодняшний день закон позволяет использовать экспертизу практически при решении любых гражданских дел. Сегодня судами используются такие виды экспертиз, наиболее распространенные, как строительно-техническая, товароведческая, бухгалтерская, почерковедческая, землеустроительная и т.д.

1. Понятие и виды экспертизы в гражданском процессе.

1.1. Понятие и роль судебной экспертизы в гражданском производстве.

Любая экспертиза по определению — это применение специальных профессиональных знаний, которые прошли апробацию опытом.

Судебная экспертиза — одна из разновидностей экспертизы, обладающая особыми признаками, описанными в процессуальном законе. Судебная экспертиза — это специальное исследование, назначаемое определением суда при наличии общего или специального оснований, проводимое сведущим лицом — экспертом, в определенной процессуальной форме для получения судебного доказательства по делу. Можно привести и другое определение: Судебная экспертиза — процессуальное действие, состоящее из проведения исследований и дачи заключения экспертом по вопросам, разрешение которых требует специальных знаний в области науки, техники, искусства или ремесла и которые поставлены перед экспертом судом, судьёй, органом дознания, лицом, производящим дознание, следователем или прокурором, в целях установления обстоятельств, подлежащих доказыванию по конкретному делу.

Термин «судебная экспертиза» означает не любая экспертиза, а лишь только та, которая используется в судебном процессе. Для неё характерна достаточно жесткая процессуальная форма. Процессуальная форма есть совокупность норм процессуального права, регулирующая порядок осуществления правосудия, порядок совершения процессуальных действий каждым из субъектов в строго определенной последовательности.

Экспертиза в суде существует благодаря тому, что она регулируется нормами процессуального права. Совокупность норм является необходимой предпосылкой возникновения правовых отношений по поводу экспертизы в процессе, а следовательно, и конкретных действий субъектов процесса, связанных с производством экспертизы, использованием её результатов для доказательственных целей. Поэтому судебная экспертиза, как институт процессуального права, направлена на осуществление правосудия.

Выявить особенности института экспертизы можно, определив сферу действия норм, т.е. предмет регулирования. Предметом правового регулирования выступают общественные отношения, которые принимают форму правовых отношений. Основанием возникновения процессуальных отношений являются процессуальные действия. Главный из них определение суда или судьи о назначении экспертизы.

Содержанием процессуальных действий выступают конкретные действия субъектов процесса. Вне правовой оболочки судебная экспертиза не существует. Вне процессуальной формы нельзя получить заключение эксперта как судебное доказательство. При нарушении процессуальной нормы при назначении экспертизы, производства экспертизы, заключении экспертизы никакого доказательственного значения она не будет иметь. Но это не означает, что любая другая экспертиза не имеет формы и установленных требований к способам проведения, экспертному заключению.

Любая экспертиза имеет определенный регламент, который фиксируется в инструкциях, методических указаниях, рекомендациях по их производству. Но такая экспертиза отличается от процессуальной, которая назначается по определению суда.

Следовательно, заключение эксперта как самостоятельный вид судебного доказательства может быть результатом только судебной экспертизы. Любое иное экспертное заключение, полученное вне процесса, не может использоваться в качестве судебного доказывания.

Судебная экспертиза — это самостоятельный правовой институт, т.е. совокупность норм процессуального права, регулирующих отношения по назначению, производству экспертизы, получению и оценке заключения эксперта.

Данные нормы регулируются через систему правоотношений, возникающих между судом и экспертом в результате совершения процессуальных действий, регламентированных законом и направленных на получение судебного доказательства.

Процессуальные действия, составляющие ядро правовой сущности экспертизы, неодинаковы по своей природе. Одни из них играют роль юридического факта, другие являются содержанием данного правоотношения т.к. в ходе получения экспертного заключения как доказательства складывается система процессуальных правоотношений. Основным юридическим фактом является определение суда о назначении экспертизы. Это определение может быть вынесено либо по ходатайству заинтересованного лица, участвующего в деле, либо по инициативе суда (судьи) (ст. 79 ГПК РФ). В первом случае основанием для возникновения правоотношений будет служить юридический состав (ходатайство и определение суда).

На основании определения между судом и экспертом складываются правоотношения по поводу производства экспертизы. Их содержание составляет, с одной стороны, действия суда, с другой — действия эксперта. К действиям суда можно отнести: привлечение сведущего лица к проведению экспертизы, требование о проведении специального исследования, контроль за законностью производства экспертизы, истребование заключения эксперта, его оценка и определение доказательственной силы. К действиям эксперта относятся: дает заключение по поставленным вопросам, знакомится с материалами дела, просит суд о предоставлении дополнительных материалов, участвует в судебном разбирательстве. При недостаточности материалов для проведения экспертизы эксперт может отказаться от дачи заключения.

Более сложные правоотношения по поводу экспертизы возникают, когда проведение экспертизы поручается не отдельному эксперту, а экспертному учреждению. Здесь правоотношения возникают между судом и экспертным учреждением с одной стороны, и судом и экспертом с другой стороны. Между судом и экспертным учреждением правоотношения возникают по поводу назначения экспертизы.

Руководитель экспертного учреждения может принять или не принять данное судом определение о назначении экспертизы, может ходатайствовать перед судом о привлечении к исследованию других специалистов не состоящие в штате экспертного учреждения, несет ответственность за надлежащее исполнение определения суда. Между экспертом и судом правоотношения возникают по поводу проведения экспертизы или точнее по поводу заключения экспертизы, его выводов при допросе эксперта, по поводу ответственности за дачу заведомо ложного заключения.

Суть экспертизы — проведение экспертом специального исследования. Уяснение сути экспертизы требует раскрыть понятие «специальные знания» и «специальное исследование». «Специальные» означает, что эксперт применяет свои профессиональные знания, и такие которые не являются общераспространенными, общеизвестными. Эти знания полученные человеком в повседневном опыте в определенной отрасли знания (в области науки, технике и пр.), за исключением правовых знаний. Судья сам обладает специальными правовыми знаниями. Эти специальные знания должны быть подкреплены специальными исследованиями.

Исследования должны быть такими фактическими данными, которые суду до этого не были известны и которые иным путем установить нельзя.

Исследования состоят из нескольких этапов:

— Определение экспертной задачи;

— Выбор методики исследования объекта;

— Получение экспертного вывода;

Структура специального исследования состоит из: подготовительной части (отбор объектов исследования, выбор методики), аналитическое исследование объекта, сравнительное исследование, синтез полученных результатов и экспертный вывод.

Экспертное исследование имеет свой объект, предмет и методику проведения объектом судебной экспертизы является источником информации для эксперта.

Объектами экспертизы могут быть материальные предметы, живые организмы. Предметом судебной экспертизы могут быть факты (фактические данные). Например, предметом психологической экспертизы может быть установление способности к правильному восприятию, запоминанию и воспроизведению информации.

Под методом понимают специальные способы применяемые для исследования объекта экспертизы. В их систему могут включаться логический, общепознавательные методы, частные инструментальные, вспомогательно-технические и специализированные методики.

Итак, судебная экспертиза состоит из двух компонентов: специальный (применение специальных знаний в форме исследования) и правовой (соблюдение процессуальной формы). Цель судебной экспертизы — получение судебного доказательства.

На основе изложенного можно выделить признаки судебной экспертизы:

— применение специальных познаний в форме исследования;

— осуществление экспертизы специальным субъектом — экспертом;

— соблюдение процессуальной формы;

— получение новых фактических данных.

Наиболее распространенная классификация по следующим основаниям: формально-специальному, процессуальному, частному предмету.

Формально-специальное основание помогает определить виды экспертиз в зависимости от их проведения: в суде и вне суда. Экспертизы вне суда в свою очередь делятся на стационарные и амбулаторные. Основная масса видов экспертиз проводится вне суда, например судебно-медицинская, судебно-психиатрическая и др.

По процессуальному критерию судебные экспертизы могут быть первичные, вторичные, дополнительные, комплексные и комиссионные.

По частному предмету весь перечень видов экспертиз определить невозможно, но наиболее распространенные следующие: гинекологическая, урологическая, почерковедческая, автороведческая, психиатрическая, товароведческая, бухгалтерская экспертизы.

Итак, судебная экспертиза — это самостоятельный правовой институт, т.е. совокупность норм процессуального права, регулирующих отношения по назначению, производству экспертизы, получению и оценке заключения эксперта.

 

1.2. Виды экспертиз в гражданском процессе.

По сравнению с уголовным процессом в гражданском процессе не существует полного перечня применяемых видов экспертиз. Существует примерный перечень экспертиз. Используя трехмерное основание классификации (предмет, объект и методику) существует девять классов судебных экспертиз, которые в свою очередь делятся на роды, виды, разновидности.

Судебно-медицинские и психофизические экспертизы: судебно-токсилогические, судебно-психиатрические, судебно-психологические.

Криминалистические экспертизы: судебно-почерковедческие, судебно-технические экспертизы документов, судебно-трассологические, судебно-баллистические, судебно-портретные, экспертиза материалов, веществ и изделий.

Судебные инженерно-транспортные, судебно-автотехнические экспертизы: воднотранспортные, авиационно-технические, железнодорожно-технические.

Судебно-экономические экспертизы: судебно-бухгалтерские, финансово-кредитные и комплексные экономические экспертизы.

Судебно-технические экспертизы: 1) по технике безопасности в промышленности и сельском хозяйстве, 2) строительно-технические, проектно-технические, 3) пожарно-технические, 4) исследование пожаров и взрывов; 5) землеустроительная экспертиза.

Судебно-экологические: комплексная экспертиза из специалистов санитарно — эпидемиологических станций, учреждений по охране лесов, вод и ученых в области экологии.

Рассмотрим более подробно некоторые из них.

В гражданском процессе используются различные виды медицинских экспертиз. Дела, возникающие из семейных правоотношений, применяется экспертиза крови, урологическая, гинекологическая, генетическая экспертиза.

Экспертиза крови. Данный вид экспертизы используется при рассмотрении дел об установлении или оспаривании отцовства. Для исследования берется кровь ребенка и родителей. При этом нужно согласие обеих сторон на проведение исследования, затем выносится определение о назначении экспертизы. Для обеспечения безопасности здоровья испытуемых, забор крови должен проводить специалист имеющий специальные познания и навыки в этой области.

Экспертиза крови на сегодняшний день не может дать утвердительный положительный ответ является ли конкретное лицо отцом ребенка. Совпадение группы крови ребенка и предполагаемого отца не исключает кровного родства, но и не подтверждает его, любой иной мужчина той же группы крови может быть потенциальным отцом ребенка. Поэтому перед экспертами не ставится вопрос о том, является ли ответчик отцом ребенка. Судья может поставить задачу перед экспертом лишь об определении отрицательного факта: исключается ли происхождение ребенка от ответчика.

Генетическая экспертиза является относительно новым видом экспертного исследования. Только генетическая экспертиза способна дать прямой и достоверный ответ является ли конкретное лицо отцом ребенка. Она основана на механизме передачи определенных наследственных признаков, которые индивидуальны для каждого человека.

Объектами генетической экспертизы могут быть выделения человека, кровь, костный материал. Если известен генотип родителей можно определить в каком соотношении новые комбинации ДНК появятся в потомстве.

Медицинская экспертиза может быть назначена и по другим гражданским делам, например, дела о возмещении вреда, причиненного здоровью работника при исполнении им трудовых обязанностей; дела о возмещении вреда, причиненного здоровью гражданина организацией, с которой он не состоит в трудовых отношениях; дела о возмещении вреда, причиненного другим гражданам; дела об увеличении или уменьшении размера присужденных сумм о возмещении вреда при изменении степени утраты трудоспособности и иные.

Основа назначения судебно-медицинской экспертизы является юридический факт — причинения вреда жизни и здоровью гражданина. Доказывание в суде входит в обязанности сторон. Истец доказывает причинение вреда лицом, названным в качестве ответчика. Но причинитель вреда не всегда может быть ответчиком. Если вред был причинен источником повышенной опасности, то ответчиком будет владелец этого источника опасности (ст. 1064 ГК РФ). Если вред был причинен работниками медицинского учреждения, вследствие неправильного лечения, то ответчиком будет не медицинский работник, а медицинское учреждение.

Судебно-психиатрическая экспертиза не входит в состав судебно-медицинской экспертизы. Она имеет самостоятельный статус в системе экспертных исследований.

Определяя круг гражданских дел, при судебном рассмотрении которых возможно использование психиатрической экспертизы, следует исходить из общих критериев, а именно: специфики подлежащих установлению юридических фактов содержащих медицинский (психиатрический) критерий. Применение психиатрической экспертизы обусловлено потребностью в установлении болезненного психического состояния гражданина.

Гражданским процессуальным законодательством предусмотрен случай обязательной судебно-психиатрической экспертизы. По делам о признании гражданина недееспособным суд, при наличии достаточных данных о психическом расстройстве гражданина назначает судебно — психиатрическую экспертизу (ст. 283 ГПК РФ). Это означает, что без заключения эксперта-психиатра гражданин не может быть признан недееспособным.

Психиатрическая экспертиза направлена на определение степени осознанности или полноценности волеизъявления, когда есть основания предполагать наличие у лица психического расстройства. В данном случае идет речь о медицинском критерии. О психиатрическом критерии можно говорить тогда, когда юридические последствия связаны с психическим расстройством.

Кроме дел о признании гражданина недееспособным, можно отнести и рассмотрение в суде спора об ограничении родительских прав, если оставление ребенка с родителями опасно для ребенка вследствие психического расстройства родителей (ст. 73 СК РФ).

Судебно-психиатрическая экспертиза может быть назначена судом и о признании гражданина, ранее признанного недееспособным, полностью дееспособным. Суд ставит вопросы перед экспертом-психологом те же, что и при назначении экспертизы об ограничении в дееспособности (ст. 286 ГПК).

Почерковедческая экспертиза может быть назначена судом в связи с заявлением одной из сторон о подложности документа (ст. 186 ГПК РФ). Данная экспертиза назначается судом как в «чистом виде», так и в сочетании с другими видами экспертиз. Например, почерковедческая экспертиза схожа с автороведческой. Эксперт исследует письменные доказательства, только почерковедческая экспертиза изучает признаки почерка, а автороведческая — признаки письменной речи. Главная задача автороведческой экспертизы — установление автора документа. Здесь предметом исследования являются стилистические, лексические признаки письменной речи.

Экспертными методами можно выявить характерные признаки пишущего лица в совокупности языковых средств, служащие для письменного изложения мысли. Иногда используется комплексная почерковедческо-автороведческая экспертиза. Для установления авторства используют различные методы, в том числе психологические, логико-психологические, психолингвистические.

Дела, связанные с установлением авторства, суд назначает авторскую экспертизу. Исследуя письменные материалы эксперт устанавливает тождественность двух произведений, совпадения и различия компонентов произведения, определяет творческий характер. Эксперт при помощи специальных методов выявляет особенности письменной речи и на основе этого делает вывод об авторстве. Суд вправе и не согласиться с выводами эксперта, если это противоречит с другими доказательствами. Суд может согласиться с выводами эксперта, если оно отвечает всем признакам судебного доказательства.

Предметом почерковедческой экспертизы является изучение признаков почерка. Главная её задача — идентификация почерка. Иногда при решении этого вопроса необходимо привлекать других специалистов, в частности психолога. Для этого назначается комплексная психолого-почерковедческая экспертиза.

Почерковедческая экспертиза по гражданским делам может быть назначена при проверке письменных доказательств. Данная экспертиза предполагает сравнительное исследование текста и подписи документа. Объектом могут быть любые письменные материалы вовлеченные в процесс. Для экспертизы требуются и свободные образцы почерка, достоверность которых несомненна.

Наряду с почерковедческой экспертизой письменных источников может применяться техническая экспертиза документов. Её задачи: определение давности, способа изготовления текста. Объектами этой экспертизы выступают текст, надпись, дата, оттиск печати.

Итак, если суд интересует идентификация текста, то назначается почерковедческая экспертиза. Если нужно определить автора текста, то автороведческая экспертиза. А если суду требуется установить давность текста или документа, то применяется техническая экспертиза документа.

Бухгалтерская экспертиза. Объектами бухгалтерской экспертизы являются документы по бухгалтерскому учету и отчетности. Основная её задача: проверка правильности ведения бухгалтерского учета, достоверность отражения в учете хозяйственных операций.

Данная экспертиза может быть важна при рассмотрении гражданских дел о возмещении материального ущерба.

В ходе бухгалтерской экспертизы дается общая оценка ведения бухгалтерского учета и подготовки бухгалтерской отчетности, выявляются и анализируются их нарушения. Ведется правильность учета отдельных операций, правильность оформления, ведения и отражения в учете кассовых операций, соответствие установленному порядку осуществляемых расчетно-платежных операций, расчетов при оплате труда, правильность формирования финансовых результатов.

Результаты экспертизы фиксируются в заключении эксперта. В аналитической части описывается ход специального исследования (факты нарушения бухгалтерского учета, нарушения действующего законодательства РФ). Вывод эксперта должен быть понятен пользователю, содержать профессиональную оценку о достоверности отчетности, был ли причинен ущерб и каков её размер.

Товароведческая экспертиза определяет способы изготовления продукции, наименование товара, страны и предприятия изготовителя, артикул, сорт, процент износа товара. При назначении экспертизы эксперту могут быть поставлены вопросы: о соответствии фактического наименования товара; что обозначено на этикетке, соответствии ГОСТам; о надлежащих компонентах товара, их замене.

При помощи товароведческой экспертизы можно определить качество вещи, степень износа. Данная экспертиза может проводится при рассмотрении гражданских дел, связанные с защитой прав потребителей. Если вред причинен товаром, изготовленным с нарушением технологии, то здесь суд может назначить технологическую экспертизу. При проведении товароведческой экспертизы используются специальные методы: измерительный, расчетный, органолептический. В заключении делается вывод о качестве изделия.

Землеустроительная эксертиза. Может быть назначена судом для установления более точных границ земельного участка. Применяется в судебных спорах при формировании земельного участка, в спорах о границах земельного участка, в спорах при установлении сервитута, т.е. ограниченного пользования чужим земельным участком и т.д.

Таким образом:

1. Термин «судебная экспертиза» означает не любая экспертиза, а лишь только та, которая используется в судебном процессе. Для неё характерна достаточно жесткая процессуальная форма. Процессуальная форма есть совокупность норм процессуального права, регулирующая порядок осуществления правосудия, порядок совершения процессуальных действий каждым из субъектов в строго определенной последовательности.

2. Судебная экспертиза является юридической формой использования специальных знаний в виде исследования (юридической формой специального исследования) для достижения определенных юридических целей. Главными отличительными признаками ее — как юридического феномена — являются: цель, особая процессуальная форма (назначение, проведение, получение результатов), субъекты. С учетом этого особые формы воплощения приобретают также предмет и объект исследования, а правовые — цель и форма — не могут не оказать определенного влияния на исследование.

Итак, судебную экспертизу определяют как исследование, проводимое экспертом на основе специальных познаний, как институт доказательственного права.

3. Суть экспертизы — проведение экспертом специального исследования. Уяснение сути экспертизы требует раскрыть понятие «специальные знания» и «специальное исследование». «Специальные» означает, что эксперт применяет свои профессиональные знания, и такие которые не являются общераспространенными, общеизвестными. Эти знания полученные человеком в повседневном опыте в определенной отрасли знания (в области науки, технике и пр.), за исключением правовых знаний. Судья сам обладает специальными правовыми знаниями. Эти специальные знания должны быть подкреплены специальными исследованиями.

4. Статья 79 ГПК РФ регламентирует вопросы назначения экспертизы. При возникновении в процессе рассмотрения дела вопросов, требующих специальных знаний в различных областях науки, техники, искусства, ремесла, суд назначает экспертизу. Проведение экспертизы может быть поручено судебно-экспертному учреждению, конкретному эксперту или нескольким экспертам.

В гражданском судопроизводстве наиболее частыми являются почерковедческие, товароведческие, строительно-технические, судебно-медицинские, судебно-психиатрические, психологические, землеустроительные экспертизы и т.д. С помощью почерковедческой экспертизы может быть установлена подлинность подписей в договорах и проч. Товароведческая экспертиза предназначена для изучения готовых товаров, их свойств, соответствия качества товара государственным стандартам, степени снижения сортности товара, соответствия качества товара прейскурантной или договорной цене и проч. По делам о разделе дома может быть назначена строительно-техническая экспертиза. Помощь судебно-медицинской экспертизы, в частности метод генотипоскопии, используется в делах об установлении отцовства.

 

2. Порядок производства экспертизы в гражданском судопроизводстве.

1.1. Порядок процессуального назначения экспертиз.

При возникновении в процессе рассмотрения дела вопросов, требующих специальных знаний в различных областях науки, техники, искусства, ремесла, суд назначает экспертизу. Проведение экспертизы может быть поручено судебно-экспертному учреждению, конкретному эксперту или нескольким экспертам.

Назначение экспертизы осуществляется путем вынесения определения суда о назначении экспертизы. Судебная экспертиза считается назначенной со дня вынесения соответствующего определения.

О назначении экспертизы суд (судья) выносит определение, в котором указываются:

— наименование суда;

— дата назначения экспертизы;

— наименования сторон по рассматриваемому делу;

— наименование экспертизы;

— факты, для подтверждения или опровержения которых назначается экспертиза;

— вопросы, поставленные перед экспертом;

— фамилия, имя и отчество эксперта либо наименование экспертного учреждения, которому поручается проведение экспертизы;

— представленные эксперту материалы и документы для сравнительного исследования;

— особые условия обращения с ними при исследовании, если они необходимы;

— наименование стороны, которая производит оплату экспертизы.

Определение о назначении экспертизы направляется либо конкретному специалисту, либо в адрес экспертного учреждения, либо группе экспертов. Если определение о назначении экспертизы направлено в адрес судебно-экспертного учреждения, то руководитель учреждения назначает экспертов, предупреждает их об уголовной ответственности за дачу заведомо ложного заключения, выполняет иные контрольные функции. При направлении определения суда в адрес конкретного эксперта (группы экспертов) он (они) также предупреждается об уголовной ответственности за дачу заведомо ложного заключения. Эксперт может отказаться от дачи заключения, если представленные ему материалы недостаточны или если он не обладает знаниями, необходимыми для выполнения возложенной на него обязанности.

Эксперту может быть заявлен отвод по основаниям, указанным в ГПК РФ.

Экспертное исследование может проводиться в зале суда или вне суда. Вне заседания экспертиза проводится, если это необходимо по характеру исследований либо при невозможности или затруднении доставить материалы или документы для исследования в заседании. Лица, участвующие в деле, вправе присутствовать при проведении экспертизы, за исключением случаев, если такое присутствие может помешать исследованию, совещанию экспертов и составлению заключения (ч. 1 ст. 84 ГПК).

Судья, назначивший судебную экспертизу, предоставляет объекты исследований и материалы дела, необходимые для проведения исследований и дачи заключения эксперта, получает образцы для сравнительного исследования и приобщает их к делу. 

Каждая из сторон и другие лица, участвующие в деле, вправе представить суду вопросы, подлежащие разрешению при проведении экспертизы. Окончательный круг вопросов, по которым требуется заключение эксперта, определяется судом. Отклонение предложенных вопросов суд обязан мотивировать.

Стороны, другие лица, участвующие в деле, имеют право просить суд назначить проведение экспертизы в конкретном судебно-экспертном учреждении или поручить ее конкретному эксперту; заявлять отвод эксперту; формулировать вопросы для эксперта; знакомиться с определением суда о назначении экспертизы и со сформулированными в нем вопросами; знакомиться с заключением эксперта; ходатайствовать перед судом о назначении повторной, дополнительной, комплексной или комиссионной экспертизы. Вопросы, поставленные перед экспертом в определении, не могут выходить за пределы его специальных знаний и не могут носить юридического характера. Вопросы должны быть определенными и конкретными, а перечень их полным. В случае если поставленные вопросы выходят за пределы специальных знаний эксперта либо материалы и документы непригодны или недостаточны для проведения исследований и дачи заключения, эксперт обязан направить в суд, назначивший экспертизу, мотивированное сообщение в письменной форме о невозможности дать заключение.

В качестве материалов для исследования могут выступать вещественные доказательства, документы, предметы, животные, трупы и их части, образцы для сравнительного исследования, а также материалы дела, по которому производится судебная экспертиза. Исследования проводятся также в отношении живых лиц.

Важным этапом процесса назначения экспертизы является определение объекта исследования, круга и содержания вопросы по которым должна быть проведена экспертиза. На объекты лежащие исследованию, указывают лица, ходатайствующие о назначении экспертизы, или они определяются судом. Окончательный выбор объектов — прерогатива суда, который представляй их для проведения экспертизы и дачи заключения эксперта. Объектами экспертного исследования могут являться человек, предметы, вещи, животные, т.е. источники (носители) информации об устанавливаемых фактах, а также образцы для сравнительного исследования. Образцы для сравнительного анализа -объекты, отображающие свойства или особенности человека, животного, предмета, материала или вещества, а также другие образцы, необходимые эксперту для проведения исследования для дачи заключения. Получение образцов для сравнительного исследования, которые приобщаются к делу, является обязанность» суда. Один из примеров — образцы почерка.

Так, в случае оспаривания подлинности подписи на документе или ином письменном доказательстве лицом, подпись которого имеется на нем, суд вправе получить образцы почерка для последующего сравнительного исследования. Получение образцов почерка судьей или судом может быть проведено с участием специалиста. О получении образцов почерка составляется протокол, в котором отражаются время, место и условия получения образца почерка. Протокол подписывается судьей, лицом, у которого получены образцы почерка, специалистом, если он присутствовал в совершении данного процессуального действия.

При проведении исследований вещественные доказательства или письменные документы с разрешения органа или лица, назначивших судебную экспертизу, могут быть повреждены или использованы только в той мере, в какой это необходимо для проведения исследований и дачи заключения. Указанное разрешение должно содержаться в определении о назначении судебной экспертизы.

Ответственность эксперта за дачу ложного заключения предусмотрена ст. 307 Уголовного кодекса РФ.

Эксперт — это лицо, обладающее специальными познаниями и привлеченное судом к участию в процессе для дачи заключения по вопросам, требующим таких познаний. В качестве эксперта может выступать гражданин, но не организация. ГПК РФ не предусматривает специальных требований к эксперту, за исключением тех ограничений, нарушение которых влечет отвод эксперта.

Эксперт подлежит отводу, если при предыдущем рассмотрении данного дела участвовал в качестве прокурора, секретаря судебного заседания, представителя, свидетеля, эксперта, специалиста, переводчика; является родственником или свойственником кого-либо из лиц, участвующих в деле, либо их представителей; лично, прямо или косвенно, заинтересован в исходе дела либо имеются иные обстоятельства, вызывающие сомнение в его объективности и беспристрастности. Эксперт, кроме того, не может участвовать в рассмотрении дела, если он находился либо находится в служебной или иной зависимости от кого-либо из лиц, участвующих в деле, их представителей.

В обязанности эксперта входит:

— принять к производству порученную ему руководителем соответствующего государственного судебно — экспертного учреждения судебную экспертизу;

— провести полное исследование представленных ему объектов и материалов дела, дать обоснованное и объективное заключение по поставленным перед ним вопросам;

— составить мотивированное письменное сообщение о невозможности дать заключение и направить данное сообщение в орган или лицу, которые назначили судебную экспертизу, если поставленные вопросы выходят за пределы специальных знаний эксперта, объекты исследований и материалы дела непригодны или недостаточны для проведения исследований и дачи заключения и эксперту отказано в их дополнении, современный уровень развития науки не позволяет ответить на поставленные вопросы;

— не разглашать сведения, которые стали ему известны в связи с производством судебной экспертизы, в т.ч. сведения, которые могут ограничить конституционные права граждан, а также сведения, составляющие государственную, коммерческую или иную охраняемую законом тайну;

— обеспечить сохранность представленных объектов исследований и материалов дела.

Эксперт не вправе:

— принимать поручения о производстве судебной экспертизы непосредственно от каких-либо органов или лиц, за исключением руководителя государственного судебно — экспертного учреждения;

— вступать в личные контакты с участниками процесса, если это ставит под сомнение его незаинтересованность в исходе дела;

— самостоятельно собирать материалы для производства судебной экспертизы;

— сообщать кому-либо о результатах судебной экспертизы, за исключением органа или лица, ее назначивших;

— уничтожать объекты исследований либо существенно изменять их свойства без разрешения органа или лица, назначивших судебную экспертизу.

 

2.2 Порядок производства экспертиз.

В ходе проведения экспертизы должны соблюдаться определенные принципы ее проведения и требования к эксперту. Так, при производстве экспертизы должен соблюдаться принцип независимости эксперта. Эксперт должен быть независим, он не может находиться в какой-либо зависимости от органа или лица, назначивших судебную экспертизу, сторон и других лиц, заинтересованных в исходе дела. Эксперт дает заключение, основываясь на результатах проведенных исследований в соответствии со своими специальными знаниями.

Не допускается воздействие на эксперта со стороны судей, прокуроров, а также иных государственных органов, организаций, объединений и отдельных лиц в целях получения заключения в пользу кого-либо из участников процесса или в интересах других лиц.

Лица, виновные в оказании воздействия на эксперта, подвергаются ответственности в соответствии с законодательством Российской Федерации. Согласно ст. 302 УК РФ принуждение эксперта к даче заключения путем применения угроз, шантажа или иных незаконных действий со стороны следователя или лица, производящего дознание, наказывается лишением свободы.

Другим принципом проведения экспертизы является объективность, всесторонность и полнота исследований. Эксперт проводит исследования объективно, на строго научной и практической основе, в пределах соответствующей специальности, всесторонне и в полном объеме. Заключение эксперта должно основываться на положениях, дающих возможность проверить обоснованность и достоверность сделанных выводов на базе общепринятых научных и практических данных.

ГПК РФ предусматривает возможность присутствия при проведении экспертизы лиц, участвующих в деле. Участники процесса, присутствующие при производстве судебной экспертизы, не вправе вмешиваться в ход исследований, но могут давать объяснения и задавать эксперту вопросы, относящиеся к предмету судебной экспертизы. При составлении экспертом заключения, а также на стадии совещания экспертов и формулирования выводов, если судебная экспертиза производится комиссией экспертов, присутствие участников процесса не допускается.

В случае если участник процесса, присутствующий при производстве судебной экспертизы, мешает эксперту, последний вправе приостановить исследование и ходатайствовать перед органом или лицом, назначившим судебную экспертизу, об отмене разрешения указанному участнику процесса присутствовать при производстве судебной экспертизы.

При производстве судебной экспертизы в отношении живых лиц могут присутствовать те участники процесса, которым такое право предоставлено процессуальным законодательством Российской Федерации. Присутствие иных участников процесса допускается с разрешения органа или лица, назначивших судебную экспертизу, и лица, в отношении которого производится судебная экспертиза, либо его законного представителя. При проведении исследований, сопровождающихся обнажением лица, в отношении которого производится судебная экспертиза, могут присутствовать только лица того же пола. Указанное ограничение не распространяется на врачей и других медицинских работников, участвующих в проведении указанных исследований.

По окончанию производства экспертизы эксперт выносит заключение.

Заключение эксперта включает в себя три части: вводную, исследовательскую и заключительную. Непосредственно выводы содержатся в заключительной (резолютивной) части. Все три части заключения эксперта являются обязательными. На основании проведенных исследований с учетом их результатов эксперт от своего имени или комиссия экспертов дают письменное заключение и подписывают его. Подписи эксперта или комиссии экспертов удостоверяются печатью государственного судебно — экспертного учреждения.

В заключении эксперта или комиссии экспертов должны быть отражены:

— время и место производства судебной экспертизы;

— основания производства судебной экспертизы;

— сведения об органе или о лице, назначивших судебную экспертизу;

— сведения о государственном судебно — экспертном учреждении, об эксперте (фамилия, имя, отчество, образование, специальность, стаж работы, ученая степень и ученое звание, занимаемая должность), которым поручено производство судебной экспертизы;

— предупреждение эксперта в соответствии с законодательством Российской Федерации об ответственности за дачу заведомо ложного заключения;

— вопросы, поставленные перед экспертом или комиссией экспертов;

— объекты исследований и материалы дела, представленные эксперту для производства судебной экспертизы;

— сведения об участниках процесса, присутствовавших при производстве судебной экспертизы;

— содержание и результаты исследований с указанием примененных методов;

— оценка результатов исследований, обоснование и формулировка выводов по поставленным вопросам.

Материалы, иллюстрирующие заключение эксперта или комиссии экспертов, прилагаются к заключению и служат его составной частью.

Документы, фиксирующие ход, условия и результаты исследований, хранятся в государственном судебно-экспертном учреждении. По требованию органа или лица, назначивших судебную экспертизу, указанные документы предоставляются для приобщения к делу.

Наиболее подробной должна быть исследовательская часть заключения эксперта, в которой дается описание проведенного исследования. Заключение эксперта должно содержать подробное описание произведенных исследований, сделанные в результате их выводы и обоснованные ответы на поставленные судом вопросы. В противном случае решение суда, которое основывается на заключении эксперта, может быть отменено.

По некоторым категориям дел заключение эксперта является обязательным и основным доказательством, без которого не может быть вынесено решение, например, по делам о признании гражданина недееспособным. Тем не менее общее правило заключается в том, что содержание заключения эксперта для суда не является обязательным и не имеет заранее установленной силы. Оно оценивается в совокупности с другими доказательствами в соответствии со ст. 67 ГПК РФ. Несогласие суда с заключением эксперта должно быть мотивировано в решении. Это необходимо для последующего обжалования решения в вышестоящий суд.

В случае недостаточной ясности, либо неполноте судом назначается дополнительная экспертиза — это экспертиза, которая проводится при недостаточной ясности или неполноте данного экспертом (комиссией экспертов) заключения. При возникновении сомнений в правильности, обоснованности заключения или противоречий между несколькими заключениями (например, противоречия в заключениях, представленных истцом и ответчиком по делу о защите прав потребителей) проводится повторная экспертиза. При назначении дополнительной или повторной экспертизы необходимо обратить особое внимание на обеспечение принципа независимости, беспристрастности, объективности эксперта.

При этом суд имеет право, но не обязан назначить дополнительную или повторную экспертизу. В случае противоречия между заключениями разных экспертов и отказа судьи назначить повторную экспертизу суд должен обосновать в решении, почему выводы суда основываются на заключении одного из экспертов и отклонено заключение другого. Суд может основать свое решение и на других доказательствах.

При недостаточной ясности или неполноте заключения суд может вызвать эксперта в судебное заседание и получить необходимые разъяснения, которые должны быть занесены в протокол.

Лица, участвующие в деле, могут ходатайствовать о назначении дополнительной или повторной экспертизы и предлагать экспертов, экспертное учреждение, в котором, по их мнению, должна быть проведена экспертиза.

Производство дополнительной судебной экспертизы, назначенной в случае недостаточной ясности или неполноты ранее данного заключения, поручается тому же или другому эксперту.

Производство повторной судебной экспертизы, назначенной в связи с возникшими у суда (судьи) сомнениями в правильности или обоснованности ранее данного заключения по тем же вопросам, поручается другому эксперту или другой комиссии экспертов.

Таким образом:

1. Использование данных специалистов в судебном разбирательстве важно для защиты прав и гарантий лиц, участвующих в процессе.

2. Статья 84 ГПК РФ регламентирует порядок проведения экспертизы. Экспертиза проводится экспертами судебно-экспертных учреждений по поручению руководителей этих учреждений или иными экспертами, которым она поручена судом.

3. Экспертиза проводится в судебном заседании или вне заседания, если это необходимо по характеру исследований либо при невозможности или затруднении доставить материалы или документы для исследования в заседании.

4. Лица, участвующие в деле, вправе присутствовать при проведении экспертизы, за исключением случаев, если такое присутствие может помешать исследованию, совещанию экспертов и составлению заключения.

В настоящее время, судебная экспертиза назначается по большому количеству гражданских дел и в большинстве случаев от результатов экспертизы зависит окончательное решение суда по делу. Вместе с тем, большое количество судебных решений отменяется вышестоящими инстанциями как необоснованные, в связи с тем, что экспертиза судом не назначалась, хотя ее назначение было необходимо для вынесения обоснованного решения, либо назначалась по ходатайства лиц, участвующих в деле, касающиеся проведения этой экспертизы, были судом отклонены. 

 

Заключение.

Исходя из требований закона о процессуальном равенстве сторон и учитывая обязанность истца и ответчика подтвердить те обстоятельства, на которые они ссылаются, необходимо в ходе судебного разбирательства тщательно проверить каждое обстоятельство, указанное сторонами в подтверждение своих требований и возражений, и тем самым обеспечить установление истины по делу.

Если у суда либо у лиц, участвующих в деле, возникнут сомнения в отношении достоверности исследуемых доказательств, их необходимо разрешить путем сопоставления с другими установленными или бесспорными фактами, проверки правильности содержания и оформления документа, назначения в необходимых случаях экспертизы и т.д. Заключение эксперта (экспертов) как средство доказывания формируется в результате исследования отдельных фактических обстоятельств дела лицами, обладающими специальными познаниями в области науки, искусства, техники, ремесла.

Экспертиза есть исследование представленных судом объектов, проводимое экспертами на базе специальных познаний и на основе с целью извлечения сведений о фактах, имеющих значение для правильного разрешения дела, совершаемое в определенном процессуальном порядке и с соблюдением установленных в процессуальном законе правил.

Виды экспертиз, применяемых в гражданском процессе так же многообразны и многочисленны, как отрасли специальных знаний. При исследовании заключения эксперта суду следует проверять его соответствие заданию, полноту, научную обоснованность содержащихся в нем выводов.

В целях разъяснения или дополнения заключения суд может вызвать для допроса эксперта. При наличии в деле нескольких противоречивых заключений могут быть вызваны эксперты, проводившие как первичную, так и повторную экспертизу.

Назначение повторной экспертизы должно быть мотивировано. Суду следует указать в определении, какие выводы первичной экспертизы вызывают сомнение, сослаться на обстоятельства дела, которые не согласуются с выводами эксперта.

Противоречия в заключениях нескольких экспертов не во всех случаях требуют повторной экспертизы. Суд может путем допроса экспертов получить необходимые разъяснения, дополнительное обоснование выводов.

Каждое доказательство (кем бы из лиц, участвующих в деле, оно ни было представлено или обосновано) должно быть судом исследовано непосредственно. Для суда никакие доказательства не должны заранее иметь преимущества перед другими.

Заключение эксперта является результатом специально проверенного исследования фактических обстоятельств дела. Гарантии фактов, отраженных в нем, достаточно высоки.

Однако это обстоятельство не дает оснований расценивать заключение эксперта как «особое», «исключительное» доказательство, имеющее «преимущество» перед другими средствами доказывания.

Предостерегая суд от подобного рода взглядов на оценку заключения эксперта, закон подчеркивает, что заключение эксперта для суда необязательно и оценивается по общим правилам оценки доказательств. Несогласие суда с заключением должно быть мотивировано в решении по делу или в определении.

В результате оценки заключения суд может признать заключение: 1) полным и обоснованным и положить его в основание решения суда: 2) недостаточно ясным или неполным и назначить дополнительную экспертизу; 3) вызывающим сомнения в его правильности и назначить повторную экспертизу.

Суд может не согласиться с выводами эксперта и, не назначая повторной экспертизы, решить дело на основании других доказательств.

Консультации, разъяснение судебной практики и представление интересов в суде по тел. 8(926)860-62-79

Обзор судебной практики Верховного Суда Российской Федерации по применению законодательства, регулирующего назначение и проведение экспертизы по гражданским делам

Образец выводов

Убедитесь, что в вашем браузере включен JavaScript. Если вы оставите отключенным JavaScript, вы получите доступ только к части предоставляемого нами контента. Вот как.

Результаты

Согласно моим экспериментам, Energizer поддерживал свое напряжение (зависимая переменная) примерно на 3% дольше (независимая переменная), чем Duracell в устройстве с низким потреблением тока. Для устройства со средним стоком Energizer сохранял свое напряжение примерно на 10% дольше, чем Duracell.Для устройства с высоким потреблением энергии Energizer сохранял свое напряжение примерно на 29% дольше, чем Duracell. В принципе, эффективность Energizer тем выше, чем больше ток потребления устройства.

Сверхмощные нещелочные батареи не поддерживают свое напряжение до тех пор, пока щелочные батареи не потребляют ток.

Выводы

Моя гипотеза заключалась в том, что Energizer прослужит дольше всех протестированных устройств. Мои результаты подтверждают мою гипотезу.

Я думаю, что тесты, которые я провел, прошли гладко, и у меня не было проблем, за исключением того факта, что батареи восстанавливают часть своего напряжения, если они в чем-то не работают. Поэтому пришлось быстро снимать мерки.

Интересное исследование в будущем может включать тестирование батарей при различных температурах для имитации фактического использования в очень холодных или очень жарких условиях.

Ознакомьтесь с нашими научными видео

Превратите йогурт в сферы с помощью обратной сферификации Превратите йогурт в сферы с помощью обратной сферификации

Почему яблоки и бананы коричневеют? — STEM-деятельность Почему яблоки и бананы коричневеют? — STEM-деятельность

Поднимите лед с пряжей STEM-активность Поднимите лед с пряжей STEM-активность

Технико-экономическое обоснование внедрения профилактического обслуживания

Автомобильный отдел, Инженерный факультет, Университет Айн-Шамс, Аббасия, Каир, Египет.([email protected])

А.А. Салем Дженерал Нил Директ Транспортная компания, Гиср Эль-Суэц, Каир, Египет.

Аннотация: Успех в управлении автопарк зависит от многих факторов. Важным является то, насколько хорошо профилактическое обслуживание выполнено.По этой причине это должен быть способ или метод, который может быть реализован для измерения или оценки выполнения профилактика. Цель данной работы — использовать стоимость ремонта. флота в качестве основы для оценки эффективности выполнения профилактическое обслуживание, и найти взаимосвязь между уровнем выполненных профилактическое обслуживание и стоимость ремонта. В этой статье новый параметр, основанный на анализе затрат. вводится.Этот новый параметр, а именно уровень обслуживания (MG), используется как мера или индикатор предварительно сформированного уровня обслуживания в различных рабочих места. Исследование затрат с использованием MG было проведено с использованием реальных полученных данных. из разных филиалов грузовой транспортной компании. Флот выбранная компания состоит из грузовиков разных марок и разных срок эксплуатации. Взаимосвязь между MG для флота туков и изучены затраты на обслуживание и ремонт грузового автомобиля.Полученные результаты дать представление об уровне выполнения профилактического обслуживания и его отношение к стоимости ремонта.

1. Введение

Запуск большой парк грузовых автомобилей эффективно, как и в случае перевозки грузов компаний, зависит в первую очередь от уровня выполненного технического обслуживания (EM) применяется к грузовикам. Выполняемое техническое обслуживание можно разделить на два основных типы.Первый тип известен как плановое техническое обслуживание и называется профилактическое обслуживание (ПМ), где второй тип называется ремонтом. Профилактическое обслуживание (ПМ) — это группа различных профилактических мероприятий, которые выполняются в заранее определенных интервалы, основанные либо на времени, пройденном расстоянии, часах работы двигателя или количество израсходованного топлива. Эти интервалы, конечно, различаются в зависимости от типа и марки грузовых автомобилей и условия их эксплуатации.В основном производитель грузовиков рекомендует эти интервалы и график, которому следует следовать. Это обозначается как плановое профилактическое обслуживание (PPM). Примеры PPM действия: замена масел, доливка масел, смазка, замена фильтров, проверка и наладка различных частей и систем грузовиков.

Другой Тип технического обслуживания (то есть ремонт) можно разделить на два вида. Первое вид — плановое техническое обслуживание, при котором агрегаты грузовых автомобилей или некоторые из их детали подлежат замене.Примеры таких ремонтных работ — обслуживание системы грузовых автомобилей (торможение, охлаждение, рулевое управление и т. д.), а также капитальный ремонт основные компоненты грузовика (двигатель, коробка передач и т. д.). Второй вид ремонта — это внеплановое обслуживание из-за отказа компонентов или дорожно-транспортных происшествий. Примерами таких ремонтных работ являются кузов, агрегаты и шасси большой грузоподъемности. ремонт.

Небрежность при проведении профилактического обслуживания, либо при его выполнении. эффективность или скорость его выполнения, приведет к увеличению ремонтов деятельность, особенно внеплановое техническое обслуживание, возникшее в результате поломки комплектующие для грузовиков.Внеплановое обслуживание считается самым дорогостоящим и следует свести к минимуму, так как он никогда не исчезнет.

Цель этого исследования — установить взаимосвязь между уровень выполненного профилактического обслуживания (ППТ) грузовых автомобилей и их стоимость ремонт. Отсюда эффективность проведенных профилактических мероприятий. об обслуживании можно судить. При проведении этого расследования различные грузовики учитываются разные марки и разный срок эксплуатации.

2. Внутренние данные

А товаров транспортная компания была выбрана в качестве источника данных для этого учиться. Выбранная компания должна была соответствовать следующим требованиям:

— Имеет большой автопарк, состоящий из грузовиков разных марок. с разным сроком эксплуатации.

— Флот распределен между несколькими компаниями филиалы (разные рабочие места).

— Компания не испытывала недостатка в запчастях или рабочая сила в период обучения.

— Компания имеет хорошие и надежные записи и система документации.

3. Подход

Для того, чтобы судить об эффективности выполненных профилактических работ в целом, по — это разные параметры, которые можно использовать. Эти параметры:

— Скорость тормоза грузовиков.

— Стоимость ремонт.

— Скорость пробег рабочий.

— The финансовая отдача от эксплуатации грузовиков.

Все Вышеуказанные параметры в некоторой степени зависят от условий работы и Политика управления транспортной компанией. Поэтому указанные выше параметры не могут можно точно использовать для сравнения двух разных рабочих мест. Следовательно, новый параметр был предложен в этом исследовании как количественная шкала измерения, который должен использоваться как мера или индикатор уровня выполнения выполнено профилактическое обслуживание.Этот новый параметр, который называется уровень обслуживания (MG) в основном основан на анализе затрат и используется на протяжении всего исследования в качестве сравнительного средства оценки уровня EPM. MG предназначен для использования в качестве меры для сравнения эффективности выполнения ремонтные работы на разных рабочих местах; учитывая, что уровень трудовые навыки и условия работы на каждом рабочем месте одинаковы.

MG — это определяется как отношение стоимости EPM к стоимости PPM.Таким образом, можно положить по форме:

Стоимость ЭПМ

МГ = ——————, (1)

Стоимость PPM

, где затраты как на EPM, так и на PPM рассчитываются для одних и тех же удаленных участков, покрытых грузовик.Плановое профилактическое обслуживание — это график технического обслуживания. рекомендовано производителем грузовика. В этом исследовании обе затраты не включают затраты на рабочую силу или накладные расходы, а также потери из-за поломки грузовика.

4. Сбор и обработка данных

Чтобы добраться до цель этого исследования, которое в основном состоит в том, чтобы получить взаимосвязь между уровень выполнения ЭПМ и стоимость запасных частей, используемых при ремонте, информация приусадебного участка важна.Тип информации или данных, необходимых для выбранная транспортная компания — это стоимость EPM, стоимость PPM и стоимость ремонта парка грузовых автомобилей в каждом филиале компании. Данные были собраны из документации компании и занесены в таблицы в специально разработанные листы данных. Таблицы данных были разработаны, чтобы содержать информацию каждой «выборочной группы» в каждом филиале. Группа образцов определяется здесь как группа грузовых автомобилей одной марки и с одинаковым сроком службы и находится в одном филиале.Данные были собраны за «период выборки». соответствует финансовому году (с июня 1990 г. по май 1991 г.). Следующий информация была собрана в этих таблицах данных (для каждой группы выборки в период выборки):

— Эксплуатация данные: (расстояние, пройденное грузовиками и

их финансовая отдача).

-Данные по профилактическому техобслуживанию: (количество масла и смазки потребляется, а также вид и количество масляных, топливных и воздушных фильтров).

— Данные о ремонте: (запасные части, используемые для обслуживания грузовых автомобилей, а также запасные части, используемые при капитальном ремонте агрегатов грузовых автомобилей и в ремонт грузовиков ДТП, в

в дополнение к количеству используемых шин и аккумуляторов.

— Данные о цене единицы: (цена каждой замененной единицы и цена использованного количества жидкостей).

Ремонт Стоимость рассчитывается путем умножения количества запчастей, использованных в ремонте, на цена каждой части.Стоимость запчастей взята из прайс-листа на время периода выборки. В этом исследовании только ремонт, связанный с рассматривается техническое обслуживание. Таким образом, следующие затраты на ремонт составили без стоимости ремонта:

— ремонт стоимость в результате ДТП,

— замена шин и аккумуляторов, а также стоимость капитальный ремонт двигателей и коробок передач, так как срок их службы превышает пробный период.

Стоимость EPM для каждой группы выборки в период выборки берется из документации компании.Стоимость EPM рассчитывается путем умножения количества материалы и запчасти б / у по их ценам. При этом затраты на ЦБК рассчитываются, как показано в Приложении (A). Из полученной информации Затраты на EPM и PPM, уровень обслуживания MG рассчитывается для каждой группы образцов. Для того, чтобы сделать сравнение между разными группами выборок более очевидным; при отрисовке всех фигур используется тарифная ставка. Ставка затрат определяется как стоимость обслуживания или ремонта за период выборки, деленная на общую расстояние, пройденное грузовиками из выборочной группы за период выборки (Л.E./1000 км). Норма стоимости ремонтов (RCR), выполненных профилактических работ. Норма затрат (EPMCR), а также общая ставка затрат (TCR) отображаются на одной диаграмме, назвал (График затрат на техническое обслуживание MG). Каждая точка на диаграмме представляет ставка стоимости выборочной группы. Этот набор кривых на диаграмме ставок затрат Ожидается, что он будет аналогичен хорошо известной таблице затрат на техническое обслуживание и ремонт показано на рисунке 1.

5. Результаты

Зная форма тренда кривых ставок затрат и использование подходящего компьютера для подбора кривой программа; кривая, соединяющая точки на графике, утонула.Из рисунка 2, который представляет собой диаграмму затрат на техническое обслуживание MG, следующее может быть нарисовано:

1-Ставка затрат на выполненное профилактическое обслуживание (EPMCR) можно представить прямой в виде:

г ₁ = а х, (2)

где: y ₁ — ставка затрат на EPM (L.E. / 1000 км), x — MG (%), a — постоянная, представляющая уклон, зависящий от марки грузовика.

2-Норма затрат на ремонт (RCR) может быть представлена ​​в виде экспоненциальная кривая с отрицательной мощностью плюс константа

по форме:

y ₂ = c e ^{-b x} + d, (3)

где: y ₂ — скорость RC (L.E. / 1000 км), x — MG (%), c, b, d положительные реальные постоянные в зависимости от марки грузовика и срока его эксплуатации.

3-Суммарная ставка затрат (TCR) — это сумма выше двух стоимостных норм и ее кривую можно представить в виде:

у = у ₁ + у ₂ , (4)

y = ax + ce ^-bx + d. (5)

4-Кривая суммарных затрат имеет минимальное значение которое может быть получено дифференцированием уравнения (5) и приравниванием результата до нуля. Оптимальное значение MG будет равно:

х = (1 / b) ln (bc / a). (6)

6.Обсуждение

Как упоминалось ранее, стоимость ремонта из-за дорожно-транспортных происшествий и стоимость ремонта капитальный ремонт основных компонентов грузовика, а также стоимость замены шины и аккумуляторы исключены из стоимости ремонта. Также стоимость износ рабочей силы, инструмента и оборудования или капитальные затраты не будут включены в этом исследовании, поскольку они выходят за рамки настоящей работы.

Данные были собраны для разных групп образцов.Значения MG были рассчитаны вместе с расценки на техническое обслуживание и ремонт. Графики расценок на техническое обслуживание MG затем построены для разных групп образцов. На представленных здесь рисунках каждая точка в кривая представляет группу образцов, эта группа образцов упоминается как разные буквы и цифры (R6, KW10, …. и т. д.). Каждая буква представляет собой грузовик производителя, а цифра обозначает срок его эксплуатации (возраст). Судя по цифрам, это может видно, что увеличение значения MG, что, в свою очередь, означает увеличение скорости Стоимость EPM, приведет к снижению нормы стоимости ремонта.Из цифр для грузовых автомобилей той же марки, но имеющих разный срок эксплуатации. На рисунке 3 показана диаграмма затрат на техническое обслуживание MG для грузовики разного возраста. Из этого рисунка видно, что по мере того, как возраст грузовиков увеличивается соответствующий наклон (MG) увеличивается. С этих склонов можно пришли к выводу, что чем больше срок службы грузовика, тем чувствительнее грузовик к изменению значения MG. Увеличение стоимости ремонта на хорошо видны старые грузовики.Кривая старого грузовика смещена вверх и право. Смещение вправо может быть связано с тем, что EPM не работает. выполняется по графику для новых грузовиков, но выполняется большую часть времени при остановке машины на ремонт (внеплановое обслуживание). Другой Причина увеличения стоимости EPM для старых грузовиков также связана со стоимостью заправки маслом двигателей и коробок передач (плохие прокладки и сальники). В низкие значения MG для новых грузовиков способствуют плохому обслуживанию операция (большие промежутки времени между выполнением ПМ).

Чтобы узнать влияние производителя грузовика на стоимость ремонта, два набора данных были использованы для построения Рисунки 4. На Рисунке 4 представлена ​​ставка затрат на техническое обслуживание MG для двух грузовиков. группы, имеющие одинаковый срок службы. Из этих кривых видно, что в Как правило, повышение уровня обслуживания снижает стоимость ремонта. Склоны кривых технического обслуживания немного отличаются из-за разницы в объем использованного масла, а также количество и стоимость фильтров, задействованных в эксплуатация.Хотя стоимость обслуживания примерно одинакова для у двух марок есть большая разница в стоимости ремонта. Этот Разница в основном связана с разницей в цене запчастей.

Когда Были тщательно изучены графики затрат на техническое обслуживание MG, два случая наблюдались в некоторых данных выборочной группы, которые здесь рассматриваются как аномальные и заслуживает пристального изучения. В первом случае, хотя стоимость EPM больше, чем стоимости PPM, которые приводят к увеличению значения MG, снижения не наблюдается в стоимости ремонта.Это указывает на то, что техническое обслуживание было чрезмерным. эксплуатации, но это мало или совсем не повлияло на техническое обслуживание грузовиков. После внутренним расследованием было обнаружено, что очевидная причина была связана с ненормальным увеличение стоимости используемого масла. Увеличение расхода масла составляет объясняется следующими причинами:

-замена моторного масла не следует рекомендация производителя, но выполняется с более короткими интервалами,

— большое количество масла используется в период обкатка двигателей и коробок передач после капитального ремонта,

— плохо прокладки и сальники приводят к многократной дозаправке

моторного масла в период между двумя последовательная замена моторного масла,

— дурная привычка гаражных техников доливать уровень моторного масла выше уровня, указанного на масляном щупе двигателя.

В Во втором случае стоимость EPM оказывается намного меньше стоимости PPM (необычно низкая стоимость МГ) и сопровождается высокой стоимостью ремонта. Считается, что это из-за ненормальных обстоятельств при проведении технического обслуживания. Этот случай тщательно исследованы, и результаты можно резюмировать следующим образом:

— возникла нехватка некоторых дорогих фильтров, из-за плохой политики администрации компании.

— операция по обслуживанию выполнена некорректно (как и в случае смазки, которая приводит к нештатной замене универсального шарниры и промежуточные опоры карданных валов).

7. Выводы

Было получено несколько результатов анализа данных. Несколько выводов могут быть составлены на основе этих результатов. Основные выводы, которые были сделаны из Полученные результаты следующие:

1- Оценка различных марок грузовиков и уровня выполнение их профилактического обслуживания может быть выполнено на основе анализа затрат.

2- Определенный параметр MG может успешно использоваться в качестве мера уровня обслуживания, выполняемого на различных рабочих местах.

3- Таблицу расценок на техническое обслуживание MG можно использовать для оценить эффективность выполнения операций PPM в различные филиалы транспортных компаний. В то же время его можно использовать для демонстрации влияния срока службы каждый грузовик вносит в общую ставку затрат на более позднем этапе, когда решение о покупке новых грузовиков.

4- Повышение уровня обслуживания MG приводит к уменьшению Стоимость ремонта. Есть оптимальная

MG, что соответствует минимальная общая стоимость. Эти оптимальные значения зависят от марки и возраста грузовика и также зависят от обслуживания и условий работы.

5- Старые грузовики (с более высоким сроком службы) очень чувствительны к халатности при проведении профилактического обслуживания, чем новые единицы.

6- Ставка затрат на техническое обслуживание MG может использоваться для изменения графика и изменить PPM относительно:

— срок эксплуатации грузовика; так что исполнительный интервал PPM следует сокращать по мере увеличения срока службы грузовика.

-марка грузовика; с учетом рабочего и исполнительного обслуживания условия.

8. Список литературы

1-Салем, А., Технико-экономическое обоснование профилактических Осуществление технического обслуживания »,

M.Sc. Диссертация, Университет Айн-Шамс, Каир, Египет, 1992.

9. Благодарность

Авторы данной статьи хотим выразить благодарность личному составу генерального Nile Direct Transport Company за помощь в предоставлении необходимых данных и документация.

ПРИЛОЖЕНИЕ (А)

Расчет стоимости PPM

ЦБК планируется в соответствии с по рекомендации производителя, выполнять через каждое определенное расстояние ехал на грузовике. PPM состоит из трех основных типов обслуживания: а именно техническое обслуживание A, B и C, которое проводится каждые 5,000, 10,000 и 40000 км соответственно. Для каждого типа обслуживания A, B и C есть несколько различных операций, которые необходимо выполнить.

Чтобы рассчитать стоимость PPM для каждой группы выборки за период выборки, некоторые шаги были выполнены. Во-первых, общее пройденное расстояние (TDT) грузовиками. в каждой группе выборки были собраны из документации компании. Во-вторых, количество плановых ТО каждого вида рассчитывалось согласно следующий:

Количество обслуживание C (NC)

TDT

NC = ———, (7)

40 000

Количество обслуживание B (NB)

TDT

NB = ——— — NC, (8)

10 000

Количество обслуживание A (NA)

TDT

NA = ——— — (NC + NE).(9)

5 000

Стоимость каждая операция, выполненная в каждом виде обслуживания, была получена из цены список за период выборки. Стоимость всех операций по каждому типу обслуживание было суммировано для каждой группы выборки. Наконец, общая стоимость PPM составила получается путем умножения стоимости каждого типа обслуживания на его номер, тогда сложил их вместе.

ПРИЛОЖЕНИЕ (B)

Список символов

EM аббревиатура на выполненное обслуживание.

Аббревиатура EPM означает выполненное профилактическое обслуживание.

EPMCR аббревиатура от произведенного профилактического обслуживания себестоимость

Сокращение MG от уровня обслуживания.

NA аббревиатура от номера техобслуживания тип А.

NC аббревиатура от номера типа обслуживания C.

NE аббревиатура от номера техобслуживания тип Б.

Акроним PM для профилактического обслуживания.

Акроним PPM для планового профилактического обслуживания.

Акроним RC от стоимости ремонта.

RCR аббревиатура от стоимости ремонта

Аббревиатура TCR от общей ставки затрат (RCR + EPMR)

TDT аббревиатура для обозначения общего пройденного расстояния. на грузовиках

в группе выборки в течение периода выборки.

Жидкие металлические наноплаватели с лейкоцитарной мембраной для активной доставки и синергетической химиофотермической терапии

Мы сообщаем о галлиевом наноплавателе с лейкоцитарной мембраной, покрытым лейкоцитарной мембраной, способном к движению с помощью ультразвука, предотвращению биологического обрастания, распознаванию и нацеливанию раковых клеток.LMGNS состоит из галлиевого ядра игольчатой ​​формы, инкапсулирующего противоопухолевый препарат, и оболочки естественной лейкоцитарной мембраны. Под воздействием ультразвукового поля LMGNS могли автономно перемещаться в биологических средах со скоростью до 108,7 мкм м с ^-1 . Скорость и направление движения LMGNS можно модулировать, регулируя частоту и напряжение приложенного ультразвукового поля. Благодаря лейкоцитарному мембранному покрытию LMGNS могут не только избегать биообрастания во время движения в крови, но также обладают способностью распознавать раковые клетки.Эти LMGNS могут активно искать, проникать и интернализироваться в раковые клетки и достигать повышенной противораковой эффективности с помощью комбинированной фототермической и химической терапии. Такой биофункциональный наноплаватель из жидких металлов представляет собой новый тип многофункциональной платформы для биомедицинских приложений.

1. Введение

Наноплаватели, которые преобразуют различные типы энергии в механическое движение [1–5], имеют большие перспективы в обеспечении решений различных будущих технологических потребностей, таких как управляемый захват [6, 7], ремонт электроники [8] ], восстановление окружающей среды [9, 10] и изготовление сложных микроструктур [11, 12].В частности, синтетические наноплаватели могут выполнять различные операции в биомедицинской области, включая биосенсор [13, 14], диагностику [15, 16], прецизионную хирургию [17], лазерную сварку тканей [18] и прямую доставку лекарств [19, 20]. ]. В последние годы для продвижения таких микро / нанопловцов использовались различные стратегии, включая химические реакции [21, 22], световые стимулы [23-25], электрические [26, 27], магнетизм [28, 29] и акустические эффекты. [30, 31] срабатывание. Однако большинство наноплавателей по-прежнему используют неорганические материалы, такие как SiO ₂ , мезопористый кремний и Fe ₃ O ₄ ; эти составы часто не могут быть использованы в биосистеме из-за системной токсичности или плохой биоразлагаемости.

Жидкий металл, биологически чистый материал с превосходными свойствами, включая низкую температуру плавления, большое поверхностное натяжение, а также высокую тепловую и электрическую проводимость [32–34], появился для растягиваемой электроники и мягких роботов [35–39]. В нашей предыдущей работе [40] мы продемонстрировали первый пример мягких стержневидных наноплавателей из жидких металлов, которые могут трансформироваться из стержня в каплю, сливаться вместе и разлагаться как в кислотном буфере, так и в биосреде раковых клеток. На сегодняшний день жидкий металл на основе галлия вызывает большой интерес в области биомедицины [41–43].Тем не менее, создание наноплавателей на основе жидких металлов, способных к активному движению, предотвращению биологического обрастания и направленной доставке лекарств, по-прежнему является проблемой.

Здесь мы демонстрируем акустически управляемый галлиевый наноплаватель, покрытый лейкоцитарной мембраной (LMGNS), который может служить в качестве многофункциональной платформы для точной терапии рака, как показано на схеме 1. Биомиметические наноплаватели были изготовлены путем комбинирования напорных фильтров. темплатный метод [40] и метод маскировки клеточной мембраны.Изготовленный LMGNS имеет игольчатую структуру, таким образом демонстрируя автономное движение под действием ультразвукового поля. Скорость и направление LMGNS можно регулировать путем изменения частоты и напряжения ультразвукового поля. Кроме того, LMGNS обладают способностью к антибиообрастанию, длительному перемещению в биологической среде и распознаванию раковых клеток. LMGNS также могут активно нацеливаться на заранее определенные раковые клетки и проникать в них. Благодаря сочетанию фототермической терапии и направленной доставки лекарств LMGNS демонстрируют повышенную противоопухолевую эффективность.

2. Результаты и обсуждение

Как показано на Рисунке 1 (a), для синтеза галлиевых наноплавателей (LMGNS), покрытых лейкоцитарной мембраной, наноплаватели галлия (GNS) были сначала изготовлены с использованием ранее описанного метода напорного фильтра-шаблона. [40]. Изображение, полученное с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM), показывает, что полученные GNS имеют игольчатую форму с длиной и диаметром на каждом конце (Рисунок 1 (b)). Изображение просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) демонстрирует, что GNS имеет структуру ядро-оболочка, а толщина оболочки составляла около 8 нм (рис. 1 (c)).Анализ картирования EDX показывает, что GNS состоят из элементов галлия и кислорода, что указывает на то, что оболочка была Ga ₂ O ₃ (Рисунок S1). Чтобы загрузить противораковое лекарственное средство, на оболочку GNS модифицировали аминопропилтриметоксисилан (APTMS) и карбонилированный β -циклодекстрин ( β -CD). После модификации инфракрасные спектры с преобразованием Фурье (FTIR) показывают, что GNS представили новые характеристические пики при 2950 см ^-1 , 1565 см ^-1 , от 1000 до 1100 см ^-1 и 1677 см ^-1 , что может соответствовать валентному колебанию CH, изгибному колебанию NH, связи Si-O от APTMS и валентному колебанию группы C = O от карбонилированного β -CD, соответственно (Рисунок 1 (d)).Спектр рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) на рисунке 1 (e) показывает три субкомпонентных пика O 1 с энергиями связи 530,8 эВ (Ga ₂ O ₃ ), 531,2 эВ (C = O) и 532,1 эВ (COC). На рисунке S2 показаны два состояния азота при 398,7 эВ (C-N) и 399,7 эВ (C-N-C). Эти результаты предполагают, что аминопропилтриметоксисилан и карбонилированный β -ЦД были успешно модифицированы на поверхности GNS.

После этого лейкоцитарные мембранные везикулы были изолированы с помощью процедуры физической экструзии [44], а затем были слиты с поверхностью GNS с помощью акустического метода слияния нанопузырьков, как показано на рисунке S3.Затем структура LMGNS была изучена с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), в которой мембраны лейкоцитов были помечены 1,1′-диоктадецил-3,3,3 ‘, 3’-тетраметилиндодикарбоцианином (DiD) перед слиянием. . Изображения CLSM показывают, что зеленая флуоресценция демонстрирует высокую степень совместной локализации с красными флуоресцентными сигналами (рис. 1 (f)). Можно подтвердить, что зеленая флуоресценция, возбуждаемая светом 488 нм, исходила от GNS. Однако источник красной флуоресценции неясен, потому что GNS также могут проявлять красную фотолюминесценцию при облучении определенной интенсивностью света 633 нм [40].Таким образом, мы проанализировали CLSM-изображения GNS и LMGNS, возбужденных светом с длиной волны 633 нм с различной интенсивностью. Как показано на рисунке S4, только LMGNS показали заметную флуоресценцию при той же интенсивности лазера, что и на рисунке 1 (f) (4 мВ), что указывает на то, что красная флуоресценция исходила от мембраны лейкоцитов, меченных DiD. Мы также обнаружили, что дзета-потенциал изменился с -13,1 мВ (GNS) до -22,9 мВ (LMGNS), что аналогично значению лейкоцитарной мембраны (рис. 1 (g)). Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что лейкоцитарные мембранные везикулы, слитые с поверхностью GNS и LMGNS, были успешно изготовлены.

Затем эти LMGNS были исследованы для транспортировки противоопухолевых препаратов, и была оценена их способность к лекарственной нагрузке, в которой доксорубицин (Dox) был выбран в качестве модельного препарата. После загрузки Dox был обнаружен характерный пик поглощения Dox при 480 нм, указывающий на успешную инкапсуляцию Dox (рис. 1 (h)). Скорость загрузки Dox определяли путем измерения массы наноплавателей до и после инкапсуляции Dox. Мы обнаружили, что масса LMGNS до и после инкапсуляции составляла 5.3 и 6,1 мг соответственно, что указывает на то, что емкость загрузки Dox составляла около 13,1% мас. Профили высвобождения Dox для GNS-Dox и LMGNS-Dox оценивали методом диализа в буфере PBS с pH 5,0 и 7,4. Высвобождение Dox из GNS-Dox и LMGNS-Dox в кислотном буфере составляло 47,4% и 72,6% в течение 4 часов, соответственно; однако в нейтральном буфере было только 5,3% и 17,7% соответственно (рис. 1 (i)). Различия в высвобожденном количестве между GNS-Dox и LMGNS-Dox как в кислых, так и в нейтральных условиях могут быть связаны с замаскированной мембраной.Эти результаты показывают, что LMGNS могут действовать как pH-чувствительный груз для доставки лекарств. LMGNS могут сохранять свою первоначальную форму в течение 6 часов в нейтральной среде (рис. 1 (j)). При воздействии кислой среды они трансформировались и сливались друг с другом (рис. 1 (k)).

Благодаря асимметричной конструкции LMGNS могут приводиться в действие ультразвуковым полем. Рисунок 2 (а) иллюстрирует взаимосвязь между скоростью LMGNS и ультразвуковой частотой с приложенным ультразвуковым полем 10 В.Скорость LMGNS увеличивалась с увеличением частоты с 390 до 417,5 кГц, а затем уменьшалась по мере дальнейшего увеличения частоты. В диапазоне частот от 415 до 425 кГц средняя скорость LMGNS может достигать более 100 мкм м с ^-1 . Рисунок 2 (b) и видео S1 показывают, что LMGNS двигались приблизительно по прямой линии со средней скоростью (тело s ^-1 ) под ультразвуковым полем с напряжением 10 В и частотой 420 кГц.Однако скорость индикаторных наносфер галлия составляла только. Эти результаты показывают, что LMGNS управляются первичной акустической радиационной силой. Благодаря свойству фотолюминесценции движение LMGNS также можно отслеживать в реальном времени с помощью визуализации флуоресценции (видео S2). Это имеет большое значение для in vivo биомедицинских приложений наноплавателей.

Ультразвуковая частота может не только регулировать скорость LMGNS, но и изменять направление их движения.Как показано на рисунке 2 (c) и видео S3, два LMGNS удалялись друг от друга в противоположных направлениях со средней скоростью 103,5 μ м с ^-1 в ультразвуковом поле 10 В, 420 кГц. Затем скорость LMGNS резко упала по мере постепенного изменения частоты за 1 с. Как только частота достигает 410 кГц, оба LMGNS начинают двигаться в обратном направлении со стабильной скоростью 33,7 мкм м / с ^-1 . На рисунке 2 (d) показано изменение направления LMGNS на рисунке 2 (c), при этом опорное направление взято в 0 с.Направление колебалось с небольшими изменениями на обеих частотах из-за эффекта броуновского движения и быстро менялось, когда частота сдвигалась на 0,7 с, что привело к резкому повороту на 180 ° для обоих LMGNS за 1,3 с. На вставленных микроскопических изображениях показан процесс вращения LMGNS 2 на временах 0,83, 0,93, 1,17 и 1,33 с. Эти результаты согласуются с предыдущими теориями о том, что сдвиг частоты приводит к изменению распределения акустического давления [45]. Между двумя частицами был узел высокого акустического давления, который заставлял LMGNS удаляться друг от друга на частоте 420 кГц. .По мере сдвига частоты распределение акустического давления постепенно изменялось, и на частоте 410 кГц формировался узел низкого акустического давления, приводящий в движение два LMGNS близко друг к другу. Мы также обнаружили, что скорость движения LMGNS можно регулировать, регулируя ультразвуковое напряжение. Была линейная зависимость между скоростью и квадратом ультразвукового напряжения В ² (рис. 2 (е)).

Одной из проблем, с которой синтетические наноплаватели сталкиваются в биомедицинских приложениях, является эффект биообрастания, который не только увеличивает вязкостное сопротивление наноплавателей, но и вызывает реакции иммунного клиренса [46].Хорошо известно, что лейкоциты — это естественные иммунные клетки, которые могут долгое время циркулировать в крови и распознавать раковые клетки с помощью белков на их клеточных мембранах [47]. Таким образом, мы ожидаем, что наноплаватели галлия, покрытые лейкоцитарной мембраной (LMGNS), могут обладать функцией лейкоцитов против биологического обрастания (рис. 3 (а)). Для оценки их способности противостоять биологическому обрастанию GNS и LMGNS соответственно инкубировали с бычьим сывороточным альбумином, меченным родамином (Rhodamine-BSA). После инкубации в течение 24 часов изображения CLSM показывают, что красный сигнал флуоресценции GNS был намного выше, чем сигнал LMGNS, что указывает на меньшее количество Родамина-БСА, прикрепленного к поверхности LMGNS (рис. 3 (b)).Для биомедицинских приложений критически важно проверить ходовые качества наноплавателей в биологических средах. Таким образом, поведение GNS и LMGNS в биологических жидкостях (сыворотке и крови) было протестировано после инкубации в этих средах в течение 24 часов. Как показано на рисунках 3 (c) и 3 (d) и соответствующих видео S4, S5, расстояния перемещения LMGNS в сыворотке и крови были больше, чем у GNS в течение того же времени. Средняя скорость GNS и LMGNS в различных биологических средах показана на рисунке 3 (e).Можно обнаружить, что скорость LMGNSs в сыворотке и крови составила 52,9 μ m s ^-1 и 35,6 μ m s ^-1 соответственно, что значительно выше, чем у GNS (31,9 μ мс ⁻¹ и 20,2 μ мс ⁻¹ соответственно). Среднеквадратичное смещение (MSD) и коэффициент диффузии (D) показывают, что LMGNS также показали более высокий коэффициент диффузии при тех же условиях (рис. 3 (f)). Эти результаты показывают, что LMGNS обладают хорошей способностью противостоять биологическому обрастанию и могут перемещаться в биологической среде в течение длительного времени.

Лейкоцитарное мембранное покрытие позволяет LMGNS активно распознавать раковые клетки нейтрофильно-подобным способом [48]; поэтому LMGNS были исследованы в терапии, направленной на раковые клетки. Во-первых, оценивалась способность LMGNS активно распознавать, искать и проникать в обработанные раковые клетки. Как показано на Рисунке 4 (а) и соответствующем видео S6, LMGNS смогли распознать клетку HeLa во время движения, перемещаемого ультразвуковым полем. Присоединение к клетке Hela и вращение LMGNS сопровождалось проникновением и интернализацией в клетку.Изображения CLSM на рисунке 4 (b) иллюстрируют положение LMGNS относительно клетки HeLa. LMGNS (зеленый) визуализируются из-за свойства фотолюминесценции жидкого металлического галлия в канале 488 нм с интенсивностью лазера 4 мВ; Между тем, DiD был использован для маркировки мембраны клетки HeLa (красный). Изображение 3D-реконструкции дополнительно демонстрирует внутриклеточную локализацию LMGNS внутри клетки HeLa (рис. 4 (c)).

Затем был исследован потенциал биомедицинского применения LMGNS.LMGNS имеют высокое поглощение в ближней инфракрасной области, что позволяет использовать их в качестве фототермического терапевтического агента [49, 50]. Как показано на рис. 5 (а), трансформация формы четко наблюдалась после облучения лазером с длиной волны 808 нм при мощности 15 мВт · мкм м ^-2 в течение 5 с, а на жизнеспособность клеток указывал кальцеин ацетоксиметил ( Кальцеин-AM) и иодид пропидия (PI). После лазерного излучения клетка HeLa, обработанная LMGNS, проявляла красную флуоресценцию, которая подтвердила некроз клетки, в то время как необработанные клетки, оставшиеся в живых, были обозначены зеленой флуоресценцией.Затем были изучены возможности транспортировки лекарств и высвобождения LMGNS. Флуоресцентные изображения на рисунке 5 (b) демонстрируют клетку HeLa, обработанную загруженными Dox LMGNS в течение 1, 2 и 4 часов. Мы также обнаружили, что клетки HeLa, инкубированные с LMGNS-Dox, демонстрировали более высокую интенсивность флуоресценции, чем группа, обработанная GNS-Dox (рис. S5), что указывает на то, что высокое поглощение LMGNS-Dox раком было приписано маскировке клеточной мембраны. Было обнаружено, что интенсивность флуоресценции клеток HeLa увеличивается при увеличении времени инкубации.Количество клеточного поглощения свободного Dox, GNS-Dox и LMGNS-Dox количественно оценивали с помощью проточной цитометрии. Наблюдался заметный сдвиг пика вправо в группе клеток HeLa, инкубированных с LMGNS-Dox (рисунки 5 (c) и S6, соответственно). Как показано на Фигуре 5 (d), результат средней интенсивности флуоресценции показывает, что клеточное поглощение LMGNS-Dox было увеличено в 2,6 раза лейкоцитарной мембраной, покрытой после 4-часовой инкубации, что дополнительно указывает на то, что клеточные мембраны, покрытые GNS, увеличивают рак. целевая эффективность.Мы также количественно оценили разницу в эффективности этих методов лечения. Анализ МТТ (рис. 5 (е)) показывает, что только 15% клеток HeLa выжили после инкубации с LMGNS-Dox в течение 4 часов. По сравнению с бесплатным лечением Dox и GNS-Dox, лечение LMGSN-Dox демонстрирует более высокую терапевтическую эффективность в отношении раковых клеток.

3. Заключение

Мы представили галлиевый наноплаватель, покрытый лейкоцитарной мембраной с акустическим приводом, для улучшенной фототермической и химической терапии рака.Асимметричная игольчатая структура и высокая плотность обеспечивают мощное движение LMGNS. Скорость и направление движения LMGNS могут контролироваться напряжением и частотой приложенного акустического поля. Интеграция лейкоцитарной мембраны позволяет LMGNS с увеличенным временем движения из-за способности антибиообрастания в биологической среде. Благодаря своей высокой абсорбционной способности в ближней инфракрасной области, отличной загрузке лекарственного средства и способности высвобождения в зависимости от pH LMGNS проявляют комбинированную фототермическую и химиотерапевтическую способность для раковых клеток.LMGNS объединяет в себе возможности активного движения, защиты от биологического обрастания, распознавания раковых клеток, визуализации, доставки лекарств и фототермического лечения рака, представляя собой современный многофункциональный наноплавательный аппарат для прецизионной тераностики следующего поколения.

4. Материалы и методы

4.1. Материалы

Галлий, аминопропилтриметоксисилан (APTMS) и карбонилированный β -циклодекстрин ( β -CD) были приобретены у Aladdin. Среда Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640), 1,1-диоктадецил-3,3,3,3-тетраметилиндодикарбоцианин перхлорат (DiD), диметилсульфоксид (DMSO), фетальная бычья сыворотка (FBS), 3- (4, Раствор 5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ), пенициллин, стрептомицин и 0.25% трипсин-ЭДТА были получены от Life Technologies Corporation; керамические преобразователи (h5P101000, ϕ ) были приобретены в Fukeda.

4.2. Получение GNS

Для синтеза GNS монодисперсные игольчатые наночастицы жидкого металла были впервые получены в предыдущем отчете [40]. Затем полученные наночастицы жидкого металла в 0,5 мл этанола вводили в 0,5 мл этанольного раствора с 10 мкл л APTMS с ультразвуковой обработкой на ледяной бане.Наночастицы жидкого металла, модифицированные APTMS, промывали этанолом и переводили в водный раствор; затем добавляли 80 мг карбонилированного β -CD при непрерывном перемешивании в течение 24 часов на ледяной бане. Полученные GNS были получены после удаления избытка карбонилированного β -CD.

4.3. Синтез LMGNS.

Клетки лейкоцитов (THP-1) сначала суспендировали в гипотоническом буфере растворения, состоящем из 0,2 мМ EDTA, 1 мМ NaHCO ₃ и 1 мМ PMSF.После обработки при 4 ° C в течение ночи эти клетки были энуклеированы 20 раз с использованием ручного гомогенизатора Даунса. После центрифугирования указанной выше суспензии при 3200 g при 4 ° C в течение 5 минут осадок лейкоцитарной мембраны был получен после центрифугирования при 150000 g при 4 ° C в течение 1 часа. Затем изолированные лейкоцитарные мембраны физически экструдировали через поликарбонатные мембраны 1 мкм, мкм, 400 нм, 200 нм, 100 нм и 50 нм за 21 проход. Затем LMGNS были изготовлены путем слияния нанопузырьков лейкоцитарной мембраны с поверхностью GNS в соответствии с опубликованным протоколом [51].Вкратце, GNS и лейкоцитарные нанопузырьки смешивали, а затем обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового аппарата Autoscience AS7240AT в ​​течение 2 часов в ледяной бане. После удаления избыточных лейкоцитарных мембранных нанопузырьков были получены LMGNS.

4.4. Акустические эксперименты

Акустическое движение LMGNS осуществлялось с помощью ультразвуковой установки, состоящей из функционального генератора (Tektronix AFG1062), усилителя сигнала (Toellner TOE 7607) и керамического преобразователя. А ячейка для образца представляет собой цилиндр высотой 1.5 мм и диаметром 5 мм, а керамический преобразователь наклеивался на дно ячейки для образцов. LMGNS инкубировали в биологических средах (вода, PBS, сыворотка и кровь) в течение 24 часов, а затем раствор LMGNS 15 мкл л по каплям добавляли в ячейку для образца и накрывали квадратным покровным стеклом. Частота 390–450 кГц и напряжение 0–10 В применялись для приведения в действие LMGNS, что наблюдалось с помощью оптического микроскопа Olympus (OLYMPUS BX53).

4.5. Эксперименты по фототермической обработке

Фототермическую терапию LMGNS наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus IX 71).Клетки HeLa с LMGNS облучались лазером с длиной волны 808 нм при мощности 15 мВт · мкм м ^-2 в течение 5 с. Затем жизнеспособность клеток определяется добавлением PI и кальцеина-AM. Наконец, полученное флуоресцентное изображение было снято при свете 488 нм.

4.6. Анализ проточной цитометрии

Поглощение клетками различных нагруженных лекарством наноплавателей оценивали с помощью анализа проточной цитометрии. GNS-Dox, LMGNS-Dox и свободный Dox с концентрацией лекарственного средства 10 мкг мкг / мл ^-1 совместно культивировали с клетками HeLa в течение 1 ч и 4 ч соответственно.После этого свободный Dox и наноплавательные средства удаляли 5-кратной промывкой раствором PBS. Затем клетки HeLa собирали, и интенсивность их флуоресценции проверяли с помощью проточной цитометрии (BD FACSAria).

4.7. MTT Assay

Для оценки их противоопухолевой эффективности PBS, свободный Dox, GNS-Dox и LMGNS-Dox сначала культивировали совместно с клетками HeLa в течение 1 и 4 часов. Затем в среду для культивирования клеток добавляли каплю 20 мл раствора МТТ с концентрацией 5 мг / мл ^-1 и инкубировали с клетками HeLa в течение 4 часов.После удаления культуральной среды к клеткам HeLa по каплям добавляли 150 мл ДМСО и измеряли жизнеспособность клеток HeLa при длине волны поглощения 570 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Вклад авторов

Q. Он и К. Ю. Гао предложили и руководили экспериментами; Д.Л. Ван провел большую часть экспериментальной работы и написал первоначальный черновик рукописи; В.Он, К. Ю. Гао, Д. Л. Ван, К. Чжоу и З. Х. Линь обсудили результаты.

Благодарности

Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (№ 21

7) и Национальной программой постдокторантуры для инновационных талантов (BX201700065).

Дополнительные материалы

Дополнительные 1. Рисунок S1: Картографические изображения GNS с помощью SEM и EDX. Рисунок S2: XPS-спектр N 1s GNS. Рисунок S3: схема, изображающая процесс подготовки LMGNS.Рисунок S4: CLSM-изображения GNS и LMGNS, возбужденных светом с длиной волны 633 нм с различной интенсивностью. Рисунок S5: изображения CLSM клеток HeLa, обработанных Dox-загруженными GNS в течение 1, 2 и 4 часов. Рисунок S6: Количественный анализ высвобождения Dox после обработки в течение 1 часа с помощью проточной цитометрии.

Дополнительный 2. Фильм S1: движение LMGNS при 420 кГц, ультразвуковое поле 10 В.

Дополнение 3. Movie S2: движение флуоресценции LMGNS при 420 кГц, поле ультразвука 10 В.

Дополнение 4. Movie S3: расходящееся движение LMGNS за счет регулирования ультразвуковой частоты.

Дополнительный 5. Фильм S4: движение GNS в сыворотке и растворе крови.

Дополнительный 6. Фильм S5: движение LMGNS в сыворотке и растворе крови.

Дополнительный 7. Фильм S6: движение LMGNS активно нацелено на клетку HeLa.

Границы | Фактор TcWRKY33, реагирующий на салициловую кислоту, положительно регулирует биосинтез таксола у Taxus chinensis прямым и косвенным путями

Введение

Таксол, также известный как паклитаксел, представляет собой специализированный метаболит, первоначально выделенный из видов Taxus , который действует как противораковое лекарственное средство (Wani et al., 1971; Schiff et al., 1979). Подобно другим вторичным метаболитам растений, таким как артемизинин и винбластин, таксол очень редко встречается in vivo (Kwak et al., 1995; White, 2008; Abdul Rahim et al., 2018). Более 20 ферментов участвуют в пути биосинтеза таксола, делая биосинтез таксола более сложным, чем биосинтез артемизинина и камптотецина (Croteau et al., 2006). Таким образом, исследования регулирующего механизма биосинтеза таксола сталкиваются с трудностями, что приводит к несоответствию между коммерческими поставками и клиническими требованиями к таксолу.

Салициловая кислота (СК) — важный эндогенный гормон растений. Он участвует в регуляции биосинтеза вторичных метаболитов, включая терпеноиды, алкалоиды и флавоноиды (Kang et al., 2004; Tounekti et al., 2013). В суспензионных культурах Taxus chinensis var. mairei , добавление 20 мг / л СК индуцирует биосинтез таксола (Wang et al., 2007). Miao et al. (2000) сообщили, что добавление 0,1 мг / л СК может увеличить производство таксола до 3 раз.SA также увеличивает концентрацию 10-деацетилбаккатина (10-DAB) и баккатина III (Miao et al., 2000). Кроме того, многие факторы транскрипции функционируют, отвечая на сигналы SA. PtrWRKY73, OsWRKY77 и BcWRKY46 отвечают на сигналы SA во время защитных реакций (Wang et al., 2012; Lan et al., 2013; Duan et al., 2015). Однако SA-индуцированные факторы транскрипции, которые регулируют биосинтез таксола, еще предстоит обнаружить.

Известно лишь несколько факторов транскрипции, регулирующих экспрессию генов биосинтеза таксола (Zhang et al., 2018b; Cui et al., 2019). Ли и др. (2013) сообщили, что фактор транскрипции WRKY группы I TcWRKY1 может связывать два W-бокса в промоторе 10-деацетилбаккатин III-10-O-ацетилтрансферазы ( DBAT ), повышая его экспрессию в T. chinensis . Ленка и др. (2015) идентифицировали три фактора bHLH, TcJAMYC1 / 2/4, показывающие потенциал для подавления нескольких генов биосинтеза таксола, таких как фенилпропаноилтрансфераза ( BAPT ), путем связывания с G- и E-боксами.Кроме того, TcJAMYC2 и TcJAMYC4 индуцируют экспрессию репортерного гена под контролем промоторов таксадиен-5-альфа-гидроксилазы ( T5H ) и таксадиен-синтазы ( TASY ) соответственно (Lenka et al., 2015). Более того, два фактора ERF (TcERF12 и TcERF15) и один фактор MYC2 (TcMYC2a) строго регулируют ген TASY , взаимодействуя с GCC- и G-подобными боксами, соответственно (Zhang et al., 2015, 2018b). Все эти факторы сосредоточены на пути передачи сигналов метилжасмоната (MJ) и, следовательно, могут эффективно регулировать биосинтез таксола.В настоящее время не сообщается о факторах транскрипции, отвечающих на SA. Следовательно, этот регуляторный механизм следует изучить.

факторов транскрипции WRKY принадлежат к одному из крупнейших семейств факторов транскрипции у растений (Eulgem et al., 2000; Robatzek and Somssich, 2001). Некоторые WRKY реагируют на лечение SA и играют важную и всеобъемлющую роль в различных физиологических процессах. Например, PtrWRKY73, фактор транскрипции WRKY группы I, реагирует на обработку СК и играет положительную роль в устойчивости растений к биотрофным патогенам (Duan et al., 2015). SA-индуцированный фактор транскрипции OsWRKY77 действует как позитивный регулятор генов, связанных с защитой / патогенезом, и делает трансгенные растения высокоустойчивыми к инфекции патогенами (Lan et al., 2013). У китайского дикой природы Vitis quinquangularis VqWRKY52 играет важную роль в SA-зависимом пути передачи сигнала и способен усиливать гибель клеток при гиперчувствительном ответе, запускаемую микробными патогенами (Wang et al., 2017).

В этом исследовании мы оценили потенциальные функции фактора транскрипции WRKY группы I TcWRKY33 в регуляции биосинтеза таксола.Мы подтвердили его индукцию обработкой SA и провели эксперименты по сверхэкспрессии и интерференции РНК, чтобы определить его влияние на содержание таксола и родственных таксанов. Уровни экспрессии генов биосинтеза таксола определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Впоследствии мы исследовали механизм молекулярной регуляции TcWRKY33 с помощью одногибридных дрожжевых анализов, двойных люциферазных репортерных систем и оценки паттернов экспрессии. Наши результаты расширяют наше понимание положительной роли факторов транскрипции TcWRKY33 в регуляции биосинтеза таксола в растениях.

Материалы и методы

Лечение растительными гормонами

Клеточная линия Taxus chinensis № 48 поддерживалась в модифицированной среде В5 Гамборга (среда 62 #) (Zhang et al., 2018a). Шесть граммов длительно субкультивированных клеток T. chinensis собирали в жидкую среду 62 # при 125 об / мин в течение 48 часов в темноте. Затем в среду добавляли 0,1 ммоль / л MeJA или 2,5 ммоль / л SA соответственно. Образцы отбирали через 0, 1, 3 и 6 ч и измельчали ​​в жидком азоте.

Выделение тотальной РНК, синтез кДНК и клонирование

TcWRKY33 Гена

Свежих листьев T. chinensis было собрано из Западного питомника Хуажонгского научно-технического университета, Вильнюс, Литва. Образцы урожая измельчали ​​в жидком азоте и использовали для выделения общей РНК. Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора RNAprep Pure Plant (TIANGEN, Пекин, Китай, Cat: DP441), и первая цепь кДНК была транскрибирована с использованием набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo, США, Cat: K1621). .

Последовательность гена TcWRKY33 была получена из данных мультиомного анализа. Было обнаружено, что он содержит два домена WRKY в своих выведенных аминокислотных последовательностях, и его полная длина была амплифицирована с использованием обратной транскрипции-ПЦР. Праймеры, названные TcWRKY33 -1F / R, показаны в дополнительной таблице 1. После амплификации с матрицей кДНК T. chinensis продукты ПЦР были клонированы T / A в вектор pMD18-T (TaKaRa, Далянь, Китай). и упорядочены.

Выравнивание последовательностей и филогенетический анализ

TcWRKY33

BLAST поиск (http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) использовали для поиска гомологии из базы данных Swiss-Prot. ClustalW online (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html) по умолчанию использовался для выравнивания и оценки процентной идентичности TcWRKY33 с известные WRKY. Результаты выравнивания были отправлены в ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi) для раскрашивания (Robert and Gouet, 2014). Филогенетический анализ был выполнен методом объединения соседей с использованием 1000 бутстреп-повторных выборок в MEGA 7.0.

Субклеточная локализация

Полноразмерная открытая рамка считывания (ORF) TcWRKY33 без терминирующего кодона была амплифицирована с использованием праймеров TcWRKY33 -2F / R в дополнительной таблице 1, а затем вставлена ​​в pCAMBIA1300-35S-sGFP с Sac I и I сайтов рестрикции, а затем рекомбинантный вектор трансформировали в GV3101. Эпидермальные клетки лука размером 1 × 1 см инфицировали положительными клонами и контролями (pCAMBIA1300-35S-sGFP) в жидкой среде 1/2 MS при 25 ° C в темноте в течение 2 дней.Затем инфицированные эпидермальные клетки лука высевали на среду MS на 2 дня при 25 ° C в темноте. Флуоресценцию GFP наблюдали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа FV1000 (OLYMPUS, Япония).

Клонирование, проверка активности и анализ промотора 5′-фланкирующей последовательности

гена TcERF15

Сначала последовательность кодирующей ДНК (CDS) TcERF15 из T. chinensis была сопоставлена ​​с последовательностями генома Taxus baccata , что позволяет предположить, что она является высококонсервативной в обоих Taxus spp.Кроме того, была получена 5′-фланкирующая последовательность этого гена T. baccata . Чтобы получить и подтвердить сходство фланкирующих последовательностей этого гена в T. chinensis , прямой праймер был сконструирован в соответствии с последовательностью гомолога T. baccata , тогда как обратный праймер был сконструирован в соответствии с последовательностью ORF в T. .chinensis (дополнительная таблица 1). После амплификации с матрицей геномной ДНК T. chinensis продукты ПЦР были клонированы T / A и секвенированы.Только те, которые содержат нетранслируемые области 5′-UTR и частичную последовательность ORF TcERF15 , считались 5′-фланкирующей последовательностью в T. chinensis .

Затем фрагмент TcERF15 был вставлен в pBI121 с сайтами рестрикции Hind III и BamH I, так что репортер β-глюкуронидазы (GUS) находился под контролем промотора TcERF15 . Конструкцией трансформировали клетки эпидермиса лука, опосредованные поражением GV3101 (Zhang et al., 2018б). Чтобы проверить его промоторную активность, было проведено окрашивание GUS в соответствии с нашим предыдущим отчетом (Li et al., 2013).

Затем 5′-фланкирующая последовательность была проанализирована для обнаружения основных цис- -элементов и W-боксов с помощью PlantCare (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/), PLACE (http : //www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html) и Nsite (http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=nsite&group=programs&subgroup=promoter).

Одногибридные дрожжи

Для векторов-жертв TcWRKY33 лигировали в pGADT7-Rec2 с сайтами рестрикции EcoR I и BamH I, в результате чего был получен рекомбинантный вектор TcWRKY33 :: pGADT7-Rec2 (дополнительная таблица 1).Для векторов-приманок были искусственно синтезированы смысловые и антисмысловые фрагменты длиной 6 пар оснований, содержащие W-боксы промоторов, которые были в четыре раза увеличены когезионными концами EcoR I и Sac I. Вектор pHIS2.1, в результате чего получается серия векторов-приманок (дополнительная таблица 1). Наконец, каждый вектор-приманка был котрансформирован с вектором-жертвой в дрожжевой штамм Y187, а затем их высевали на среду с дефицитом SD / Leu- / Trp- / His с 20/40 мМ 3-AT в течение 3-5 дней. дней.Каждый вектор приманки, котрансформированный вместе с пустой pGADT7-Rec2, использовали в качестве отрицательного контроля.

Конструирование сверхэкспрессии и векторов РНКи

Полноразмерный TcWRKY33 был амплифицирован из вектора TcWRKY33 :: pMD18-T с использованием специфических праймеров TcWRKY33 -3F / R в дополнительной таблице 1 и вставлен в вектор с сайтом рестрикции Nco I. вектор сверхэкспрессии TcWRKY33 :: pCAMBIA3302. Для вектора РНКи 3′-CDS-фрагмент 376 п.н. TcWRKY33 был вставлен прямо и обратно в вектор LH-FAD2-1390RNAi, так что два фрагмента и фрагмент FAD-RNAi будут генерировать стволовую петлю в клетках ( Дополнительная таблица 1).Затем рекомбинантные векторы трансформировали в LBA4404, и LBA4404, содержащий пустой вектор pCAMBIA3302 или LH-FAD2-1390RNAi, использовали в качестве контроля, соответственно.

Переходная трансформация

TcWRKY33 в T. chinensis Листья

Для временных трансформаций листьев Taxus отдельные колонии LBA4404, содержащие пустые векторы, TcWRKY33 :: pCAMBIA3302 и TcWRKY33 :: LH-FAD2-1390RNAi, культивировали в 20 мл среды LB600 (LB). = 0.6–0,8, а затем их собирали и ресуспендировали в 20 мл жидкой среды MS половинной концентрации, содержащей 200 мкМ ацетосирингона. Свежие листья собирали с кончиков лезвий у 10-летних горшечных растений T. chinensis . После дезинфекции поверхности стерильным скальпелем делали небольшие надрезы на внутренней поверхности листьев, чтобы облегчить заражение Agrobacterium . Затем поврежденные листья культивировали на шейкере при 125 об / мин в течение 12 ч в темноте при 28 ° C. После этого было заражено T.chinensis помещали на твердую среду 1/2 MS на 24 ч при 28 ° C в темноте. Наконец, часть листьев помещали в жидкий азот и затем хранили в холодильнике при -80 ° C для следующих экспериментов, а остальные погружали в стерильную воду, встряхивая при 120 об / мин, на 6 дней для проверки содержания таксола. и 10-DAB.

Количественная ПЦР в реальном времени и высокоэффективная жидкостная хроматография

Количественная ПЦР в реальном времени была проведена, как описано ранее (Zhang et al., 2015), а для статистического анализа были получены три полностью независимых биологических повтора (дополнительная таблица 1). Каждый эксперимент проводился трижды, и мы использовали тест Стьюдента t . Обработанные листья сушили при 60 ° C в течение 24 ч и измельчали ​​до 40 меш. Сначала точно взвешивали 0,1 г порошка и помещали в центрифужную пробирку на 10 мл, а затем добавляли 3 мл метанола. Процедуру экстракции проводили с использованием ультразвуковой машины (Kunshan KQ-250E, Китай) в течение 30 минут, центрифугировали в течение 10 минут при 8000 об / мин и повторяли три раза, а верхнюю фазу собирали и сушили с помощью N-Evap ( Autoscience MTN-2800D, Китай).Образцы таксана разбавляли метанолом для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и затем пропускали через мембранные фильтры (0,22 мкм) перед обнаружением ВЭЖХ. Каждый эксперимент проводился в трех экземплярах. Экстракционные соединения анализировали с использованием системы ВЭЖХ Agilent 1290 в сочетании с колонкой с фенил-C18 (250 × 4,6 мм, 4,6 мкм). Хроматографическое разделение выполняли с помощью процесса градиентного элюирования подвижной фазы воды (A) и ацетонитрила (B) следующим образом: 0–10 мин, 5–40% B; 10–15 мин, 40–50% B; 15–30 мин, 50–80% B; 30–35 мин, 80–95% B.Скорость потока составляла 1,0 мл / мин при объеме впрыска 20 мкл. Кроме того, температура колонки и длина волны обнаружения поддерживались на уровне 30 ° C и 227 нм соответственно.

Анализы эффектор-репортер

Для анализа двойной люциферазной активности исходный промотор 383 п.н. DBAT / промотор 715 п.н. TcERF15 и две прогрессивные делеции, удаляющие W _a -box / W ₁ -box и W _b -box / W ₂ -box клонировали с сайтами рестрикции Hind III и BamH I и вставляли в вектор pGreenII-0800-Luc для создания репортерного вектора (дополнительная таблица 1).Затем TcWRKY33 :: pCAMBIA3302 действовал как эффекторный вектор. Каждый репортер и эффектор временно экспрессировались в листьях Nicotiana benthamiana через штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101. Инфильтрованные растения выращивали в теплице в течение 24 часов в темноте, а затем выращивали в естественных условиях в течение 2 дней, и активность люциферазы измеряли с помощью набора для анализа двойного люциферазы-репортера (Vazyme).

Результаты

TcWRKY33 Фактор, реагирующий на SA

Салициловая кислота и MJ увеличивают производство таксола (Yukimune et al., 1996; Miao et al., 2000). Факторы транскрипции WRKY являются важными регуляторами передачи сигналов SA и MJ, а DBAT и TASY отвечают на сигналы SA и MJ (Zhang et al., 2017). Таким образом, анализ паттернов гормонального ответа TcWRKY33 обогатит наше понимание регуляторной сети биосинтеза таксола.

Обработка фитогормоном

была проведена на клетках T. chinensis , и мы измерили экспрессию TcWRKY33 с помощью qRT-PCR.Экспрессия TcWRKY33 была немного выше через 1 и 3 часа после обработки SA по сравнению с таковой до лечения, но увеличивалась в 3,24 раза через 6 часов после индукции SA. Однако экспрессия TcWRKY33 и не показала очевидных различий после обработки MJ. Следовательно, TcWRKY33 значительно ответил на сигнал SA, но не на MJ (рис. 1A). Ответ TcWRKY33 на SA не был немедленным; накопление транскриптов TcWRKY33 после индукции СК потребовало времени.

Рисунок 1 . Индукция TcWRKY33 салициловой кислотой (SA) и метилжасмонатом (MJ) и экспрессия генов биосинтеза таксола и TcERF15 при лечении СК. (A) Относительная экспрессия TcWRKY33 в ответ на SA и MJ. (B) Относительная экспрессия TcERF15 и генов биосинтеза таксола в ответ на SA. Клетки собирали в разное время (0, 1, 3 и 6 ч) после обработки. Актин использовался как эндогенный эталон.Статистический метод для значения p был тестом Стьюдента t . Звездочки указывают на значимость, ^* 0,01 < p <0,05 и ^** p <0,01.

Помимо TcWRKY33 , многие гены биосинтеза таксола также реагировали на сигналы SA. Уровни экспрессии DBAT, TASY, T5H, 5-альфа-таксадиенол-10-бета-гидроксилазы ( T10H ), таксан-2-альфа-O-бензоилтрансферазы, 3 ′ -N-дебензоилтаксол-N-бензоилтрансферазы ( DBTNBT ) и таксадиенол ацетилтрансферазы ( TAT ) были увеличены на 2.В 26-, 1,47-, 2,29-, 2,49-, 3,10-, 3,60- и 3,99 раз, соответственно, через 6 часов после обработки SA по сравнению с контролем (Рисунок 1B), что указывает на то, что эти гены биосинтеза таксола положительно реагируют на сигналы SA .

TcWRKY33 является ядерно-локализованным фактором транскрипции WRKY группы I

Онлайн-поиск по базе данных SWISS-Prot показал, что TcWRKY33 имеет наибольшее сходство с факторами транскрипции WRKY, SUSIBA2 и AtWRKY20, и, таким образом, может функционировать как активатор (Sun et al., 2003; Nagata et al., 2012). Выравнивание последовательностей показало, что предполагаемый TcWRKY33 содержит два консервативных домена WRKY на N-конце и C-конце, за которыми следует мотив цинкового пальца типа Cys2 / His2; он, следовательно, представляет члена группы транскрипционных факторов WRKY (рис. 2А). Белок TcWRKY33 также содержит мотив LSPLL, который присутствует во многих факторах транскрипции и кофакторах и опосредует взаимодействия, которые активируют или подавляют транскрипцию (Plevin et al., 2005). Филогенетический анализ показал, что белок TcWRKY33 был тесно связан с членами семейства WRKY группы I, разделяя наибольшее сходство с AtWRKY20 (рис. 2B).

Рисунок 2 . Выравнивание последовательностей, филогенетический анализ и субклеточная локализация TcWRKY33 . (A) Выравнивание аминокислотной последовательности TcWRKY33 и других WRKY в Arabidopsis thaliana, Capsicum annuum, Nicotiana tabacum и Oryza Sativa . (B) Филогенетический анализ TcWRKY33 и других WRKY. TcWRKY33 подписан синим цветом. (C) Слитый белок TcWRKY33 и GFP трансформировали в эпидермальные клетки лука. Флуоресценцию GFP наблюдали через 2 дня после заражения с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа FV1000 (OLYMPUS, Япония) с увеличением 10 × 20.

Субклеточная локализация в эпидермальных клетках лука для проверки сайта активности TcWRKY33 показала, что TcWRKY33 является локализованным в ядре белком (рис. 2С).Большинство факторов транскрипции функционируют в ядре; в частности, факторы WRKY являются ДНК-связывающими белками, что указывает на их локализацию в ядре (Ciolkowski et al., 2008).

TcWRKY33 активирует семь генов, участвующих в биосинтезе таксола

Биосинтез таксола — сложный процесс, в котором задействовано множество ферментов (рис. 3А). Чтобы идентифицировать функцию TcWRKY33 в регуляции экспрессии генов биосинтеза таксола, мы временно сверхэкспрессировали TcWRKY33 в листьях Taxus .Уровни экспрессии генов биосинтеза таксола исследовали с помощью qRT-PCR. Экспрессия TcWRKY33 в трансформированных листьях была в 5,72 раза выше, чем в контроле (фигура 3B). Уровни транскрипции DBAT, TASY , 2 -альфа-гидроксилазы ( T2H ), T5H, T10H, TAT и DBTNBT составляли 3,85-, 2,27-, 2,81-, 2,01-, 1,74-, В 2,84 и 4,19 раза выше в листьях, сверхэкспрессирующих TcWRKY33 , чем в контроле (рис. 3В).Напротив, экспрессия BAPT была в 0,57 раза больше, чем в контроле (рис. 3B).

Рисунок 3 . TcWRKY33 способствовал биосинтезу таксола и 10-DAB путем прямой активации DBAT через связывание с W-боксами в его промоторе. (A) Упрощенная схема пути биосинтеза таксола. TASY , таксадиен-синтаза; T5H , таксадиен-5-альфа-гидроксилаза; T7H , ген 7-альфа-гидроксилазы; T10H , 5-альфа-таксадиенол-10-бета-гидроксилаза; T13H, ген 13-альфа-гидроксилазы; T2H, ген 2-альфа-гидроксилазы; ТАТ, таксадиенол ацетилтрансфераза; TBT, таксан-2-альфа-O -бензоилтрансфераза; DBAT , 10-деацетилбаккатин III-10- O -ацетилтрансфераза; BAPT, фенилпропаноилтрансфераза; DBTNBT, 3′- N -дебензоилтаксол N -бензоилтрансфераза. (B, C) Уровни экспрессии генов биосинтеза таксола были количественно определены в TcWRKY33 сверхэкспрессированных и РНК интерференционных листьях с использованием qRT-PCR. Актин использовали в качестве контрольного гена, каждый эксперимент проводили по три повтора, и всего использовали три биологических повтора, и статистический метод для значения p представлял собой тест Стьюдента t . Звездочки указывают на значимость, * 0,01 < p <0,05 и ** p <0,01. (D, E) Содержание таксола и 10-DAB определяли количественно в TcWRKY33 сверхэкспрессированных и переходных листьях с интерференцией РНК с помощью ВЭЖХ.Содержание таксола в группе СК было справочным. (F) Принципиальная схема промотора DBAT . Два оранжевых пятиугольника обозначают два W-прямоугольника. (G) Дрожжи — один гибрид TcWRKY33 и W-боксов в дрожжах. Связанный вектор приманки с каждым W-боксом трансформировали совместно с вакантным pGADT7-Rec2 в Y187 в качестве контроля. (H) Схематические диаграммы эффекторного вектора и репортерных векторов. Плазмида экспрессии TcWRKY33 находилась под контролем промотора 35S CaMV.Эффекторные и репортерные векторы совместно трансформировали в листья табака и количественно определяли экспрессию LUC / Rluc. Различные буквы указывают на значительную разницу ( p > 0,05) между видами лечения, основанными на тесте множественных диапазонов Дункана из SPSS Statistics 21, SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США.

Мы также вмешались в экспрессию TcWRKY33 в свежих листьях Taxus , используя технологию транзиторной РНКи. Уровни экспрессии TcWRKY33 в листьях РНКи равнялись 0.47, чем в контроле (рис. 3C). Уровни экспрессии генов биосинтеза таксола измеряли с помощью qRT-PCR. Уровни транскрипции большинства генов биосинтеза таксола, включая DBAT, TASY, T2H, T5H, 13-альфа-гидроксилазу ( T13H ), TAT и DBTNBT , составляли 0,50, 0,67, 0,19, 0,35, 0,37, 0,42 и 0,41 раза больше, чем в контроле; однако T10H показал уровни экспрессии в 2 раза выше, чем в контроле (рис. 3C). Эти результаты подтвердили, что TcWRKY33 значительно усиливает экспрессию генов биосинтеза таксола, особенно ключевых генов биосинтеза DBAT и TASY .Мы выбрали эти два гена для дальнейшего изучения, чтобы изучить механизмы регуляции TcWRKY33 на генах биосинтеза таксола.

TcWRKY33 Стимулирует накопление таксола и 10-DAB

Чтобы дополнительно определить влияние TcWRKY33 на биосинтез таксола, мы измерили содержание таксола и 10-DAB (предшественник таксола и продукт DBAT ) с помощью ВЭЖХ в листьях T. chinensis , временно сверхэкспрессирующих TcWRKY33 или TcWRKY33 . с экспрессией TcWRKY33 , подавленной посредством РНК-интерференции.Таксол накапливался в листьях с повышенной экспрессией TcWRKY33 до 1,20 раз выше, чем в контроле (фигура 3D). Кроме того, уровни 10-DAB были в 2,09 раза выше, чем в контроле (рис. 3D). В TcWRKY33 -RNA-интерференционных листьях содержание таксола было только 0,89, чем в контроле (рис. 3E). Накопление 10-DAB также было ниже, чем в контроле, на 0,49 (рис. 3E). Эти результаты показывают, что фактор транскрипции TcWRKY33 эффективно улучшает биосинтез таксола.Более того, TcWRKY33 , по-видимому, тесно связан с содержанием 10-DAB, который является предшественником таксола, продуцируемого DBAT .

TcWRKY33 Непосредственно активирует DBAT путем связывания с W-боксами в своем промоторе

Li et al. (2013) обнаружили два W-бокса (W _, -бокс при -363 п.н. и W _b -бокс при -252 п.н.) в пределах -368 п.н. от промотора DBAT ; эти W-боксы являются функциональными сайтами TcWRKY1, фактора WRKY группы IIa (Li et al., 2013; Zhang et al., 2018a). DBAT , обычно считающийся одним из ключевых ферментов в биосинтезе таксола, был значительно активирован TcWRKY33 . Таким образом, DBAT оказывается прямой целью TcWRKY33 . Мы проанализировали промотор гена DBAT на предмет потенциальных цис- -элементов, регулируемых TcWRKY33 (рис. 3F). Четыре тандемных повтора двух W-боксов (6 п.н.) по отдельности лигировали в pHIS2.1 и, соответственно, совместно трансформировали слитым вектором TcWRKY33 -AD в дрожжевые клетки Y187.Скрининг на планшетах со средой SD / -Trp / -Leu / -His + 20 мМ 3-AT показал, что TcWRKY33 может связываться с двумя фрагментами (фигура 3G).

Далее мы клонировали полноразмерный промотор 383 п.н. DBAT и две прогрессивные делеции, удалив бокс W _a и бокс W _b , в люциферазные репортерные векторы и, соответственно, котрансформировали их с помощью TcWRKY33 эффекторный вектор в листьев N. benthamiana (фиг. 3H). Значения LUC / Rluc были уменьшены, когда W-блоки были удалены из промоторов.Эти результаты предполагают, что TcWRKY33 активирует экспрессию нижележащих генов путем связывания с двумя W-блоками в промоторе DBAT (фиг. 3H). Отношение LUC / Rluc уменьшилось больше, когда оба W-бокса были удалены, чем когда был удален только W _a -box, что указывает на то, что W _b -box может быть наиболее важным сайтом связывания для TcWRKY33 с наилучшим активационная активность (рис. 3H).

TcWRKY33 Активирует активатор TASY путем связывания с W-боксами в промоторе TcERF15

Экспрессия TASY , кодирующего один из наиболее важных ферментов, участвующих в биосинтезе таксола, также была активирована транскрипционным фактором TcWRKY33 .Однако этот ген, по-видимому, не содержит W-бокса в своем промоторе. Это свидетельствует о наличии промежуточного регуляторного фактора между TcWRKY33 и TASY . Поиск сообщенных регуляторов выявил TcERF15 , положительный регулятор гена TASY , который содержит два W-бокса в своем промоторе (Zhang et al., 2015). После индукции SA экспрессия TcERF15 увеличивалась в 2,66 раза через 3 часа (рис. 1B), что указывает на то, что TcERF15 положительно реагировал на сигналы SA.Когда мы временно сверхэкспрессировали TcWRKY33 в листьях T. chinensis , экспрессия TcERF15 была немного, но значительно выше в 1,24 раза по сравнению с контрольной группой (рис. 4A). Однако экспрессия TcERF15 была в среднем 0,47 раза выше, чем в контроле в листьях, временно экспрессирующих конструкцию интерференции РНК TcWRKY33 , что указывает на то, что TcERF15 , вероятно, участвует в регуляции TcWRKY33 (фиг.4A).

Рисунок 4 . TcWRKY33 активировал TASY путем связывания с промотором TcERF15 . (A) Уровни экспрессии TcERF15 были количественно определены в TcWRKY33 сверхэкспрессированных и заглушенных листьях с помощью qRT-PCR. Звездочки указывают на значимость, ** p <0,01. (B) Экспрессия GUS в трансформированных клетках эпидермиса лука через 48 часов. Нетрансформированные клетки эпидермиса лука в качестве отрицательного контроля, трансформированные клетки эпидермиса лука с pBI121-pro _TcERF15 :: GUS были окрашены в синий цвет с помощью X-gluc. (C) Дрожжевой моногибридный анализ взаимодействий между TcWRKY33 и W-боксом. Штаммы дрожжей были серийно разведены, и 2,5 мл каждого разведения высевали на синтетическую выпадающую среду без Leu и Trp (SD-LW) или синтетическую выпадающую среду без Leu, Trp и His (SD-LWH) плюс 40 мМ 3-аминотриазола. (3AT). (D) Принципиальная схема промотора TcERF15 . Промотор TcERF15 содержал два W-бокса, подписанных пентаклями. Это была схематическая карта построения полноразмерного промотора TcERF15 и двух прогрессивных удалений, удаляющих W ₁ -box и W ₂ -box. (E) Эффекторный и репортерный векторы были совместно трансформированы, и была обнаружена экспрессия LUC / Rluc. Различные буквы указывают на значительную разницу ( p > 0,05) между видами лечения, основанными на тесте множественных диапазонов Дункана в SPSS Statistics 21.

Мы получили 5′-фланкирующую последовательность 715 п.н. TcERF15 . Окрашивание GUS показало, что эта последовательность может способствовать экспрессии репортерных генов и, таким образом, является фрагментом промотора (фиг. 4B). Онлайн-инструменты идентифицировали два W-бокса в промоторе TcERF15 : 5′-TTGACT-3 ‘при -700 п.н. (названный W ₁ -бокс) и 5′-TTGACG-3′ при -452 п.н. (обозначенный W ₂ -в коробке).Мы увеличили в 4 раза каждый фрагмент длиной 6 пар оснований из промотора TcERF15 и мутантные фрагменты и лигировали их отдельно в pHIS2.1; эти конструкции были, соответственно, котрансформированы вектором слияния TcWRKY33 -AD для обнаружения взаимодействия в дрожжевой одногибридной системе. Положительные клоны, содержащие вектор слияния TcWRKY33 -AD и векторы-приманки W-box, росли на Trp-, Leu- и His-дефицитной среде с 40 мМ 3-AT, тогда как контрольные клоны этого не делали. Это указывает на то, что TcWRKY33 взаимодействует с W-боксами в промоторе гена TcERF15 (фиг. 4C).

Эксперимент с одним гибридом дрожжей показал, что два W-бокса промотора TcERF15 были прямыми мишенями для TcWRKY33 in vitro . Для дальнейшего пояснения мы временно котрансформировали полноразмерные репортерные векторы промотора TcERF15 и два вектора с прогрессирующей делецией, соответственно, вместе с TcWRKY33 в листьев N. benthamiana (фиг. 4D). Экспрессия LUC / Rluc была ниже, когда блок W ₁ был удален по сравнению с экспрессией с полноразмерного промотора TcERF15 , что указывает на то, что TcWRKY33 может активировать экспрессию репортерных генов путем связывания с W ₁ — коробка.Однако, когда оба W-бокса были удалены, отношение LUC / Rluc было выше, чем когда отсутствовал только W ₁ -бокс. Это предполагает, что TcWRKY33 играет отрицательную регуляторную роль при взаимодействии с W ₂ -box. Уровень экспрессии LUC / Rluc был ниже, чем у полноразмерной промоторной последовательности, что указывает на то, что активирующая функция бокса W ₁ на TcWRKY33 сильнее, чем отрицательная регуляторная роль W ₂ — коробка (рисунок 4E).

Обсуждение

Таксол представляет собой ценный вторичный метаболит, который первоначально был выделен из Taxus spp. и широко используется в качестве противоопухолевого препарата (Rowinsky et al., 1990). Однако он обнаружен в очень низких количествах в деревьях Taxus , что делает его слишком дорогим для получения таким способом (Walker and Croteau, 2000). Предыдущее исследование с использованием клеточных линий со сверхэкспрессией TcWRKY показало, что эти факторы транскрипции могут оказывать значительное влияние на регуляцию биосинтеза таксола (Zhang et al., 2018а). SA также улучшает накопление таксола (Miao et al., 2000). В этом исследовании мы выделили SA-индуцированный фактор транскрипции WRKY, TcWRKY33 , чтобы изучить его функцию в биосинтезе таксола.

Два W-бокса (W _-бокс и W _b -бокс) в промоторе DBAT являются основными SA-чувствительными элементами (Li et al., 2013). Таким образом, факторы транскрипции WRKY должны быть ключевыми для передачи сигналов SA в ген DBAT и, возможно, весь путь биосинтеза таксола.Однако, несмотря на взаимодействие с двумя W-блоками, TcWRKY1 отвечает только на сигналы MeJA (Li et al., 2013). Мы показали, что TcWRKY33 сильно отвечает на SA, обеспечивая отсутствующий SA-чувствительный регулятор WRKY в биосинтезе таксола. Из семи факторов транскрипции TcWRKY, выбранных из данных транскриптомов для подтверждения их функции в отношении сигналов SA и MeJA (Zhang et al., 2018a), только два были активированы после лечения SA. Они также были активированы MJ, который, как считается, ингибирует ответ SA. TcWRKY33 , таким образом, имеет значительное преимущество, поскольку индуцируется только сигналами SA.

TcWRKY33 сильно стимулировал накопление таксола и 10-DAB. Более того, уровни экспрессии большинства генов биосинтеза таксола увеличивались при сверхэкспрессии TcWRKY33 . Это особенно верно для DBAT и TASY , которые признаны наиболее важными ферментами в биосинтезе таксола. Уровни экспрессии этих генов биосинтеза таксола значительно снижались, когда подавлялся TcWRKY33 .Это выявило, что TcWRKY33 функционирует как активный регулятор биосинтеза таксола путем усиления экспрессии большинства генов биосинтеза таксола, включая DBAT и TASY ; это согласуется с другими факторами транскрипции WRKY группы I, функционирующими как активаторы (Zheng et al., 2006; Li et al., 2015).

Наши эксперименты с одним гибридом и двумя люциферазными репортерами дрожжей подтвердили, что TcWRKY33 активирует экспрессию DBAT путем взаимодействия с двумя W-блоками в его промоторе.Блок W _b показал большую активационную активность, чем блок W _a . Кроме того, уровни предшественника таксола 10-DAB, продукта DBAT , также увеличились до 2,09 раза после того, как DBAT был активирован TcWRKY33 . Это подтверждает, что TcWRKY33 увеличивает содержание 10-DAB и таксола путем прямой активации экспрессии DBAT . Аналогичные результаты были получены на других заводах. Например, у Hylocereus monacanthus HmoWRKY40 транскрипционно активирует HmoCYP76AD путем связывания с его промотором и участвует в регуляции биосинтеза питайи-беталаина (Zhang et al., 2021). В Ophiorrhiza pumila OpWRKY2 положительно регулирует биосинтез противоракового лекарственного средства камптотецина путем связывания и активации гена центрального пути камптотецина OpTDC (Hao et al., 2021). Таким образом, факторы транскрипции WRKY влияют на биосинтез вторичных метаболитов, регулируя экспрессию ключевых генов ферментов в их путях биосинтеза. Однако TASY , один из наиболее важных ферментов биосинтеза таксола, который сильно реагирует на SA, по-видимому, не имеет W-бокса в своем промоторе.Таким образом, TcWRKY33 активирует уровни своей экспрессии другими способами.

TcERF15 , активатор TASY , был активирован в листьях, временно сверхэкспрессирующих TcWRKY33 . Анализ промотора выявил два W-бокса в промоторе TcERF15 . Анализы дрожжевого одногибридного и двойного репортерного люциферазы дополнительно подтвердили, что TcWRKY33 активирует TcERF15 путем связывания с двумя W-блоками. Следовательно, TcWRKY33 напрямую взаимодействует с W-боксами в промоторе DBAT , чтобы активировать экспрессию DBAT .Он также немного увеличивает экспрессию TcERF15 , повышая регуляцию TASY . Подобные результаты наблюдались у Catharanthus roseus . Например, CrWRKY1 играет ключевую роль в определении накопления серпентина в корнях путем активации нескольких ключевых генов пути TIA, особенно триптофан декарбоксилазы , а также репрессоров транскрипции ZCT1 (цинк-палец транскрипция C. roseus ). фактор 1), ZCT2 и ZCT3 (Suttipanta et al., 2011). В яблоках с красной мякотью MdWRKY11 связывается с W-боксами в промоторах MdHY5, MdMYB10 и MdMYB11 , регулируя их активность. Он также связывается с промотором UFGT , кодирующим ключевой структурный ген в пути биосинтеза антоциана, для усиления экспрессии UFGT . Следовательно, MdWRKY11 участвует в биосинтезе антоцианов, опосредованном MdHY5, , и регулирует экспрессию транскрипционных факторов MdMYB10, MdMYB11, и UFGT в плодах яблони (Liu et al., 2019). Эти факторы транскрипции WRKY, очевидно, регулируют биосинтез вторичных метаболитов эффективно и широко посредством различных паттернов регуляции. Кроме того, наши результаты показывают превосходство TcWRKY33 в биосинтезе таксола.

TcWRKY33 четко отвечает на сигналы SA и передает эти сигналы SA нижестоящим генам. Кроме того, TcWRKY33 , по-видимому, регулирует следующие гены, такие как DBAT и TASY , двумя способами. DBAT отвечает на сигналы SA, которые передаются напрямую в DBAT через TcWRKY33 , взаимодействующий с W-блоками. Ген TASY более чувствителен к стимулам MeJA, и этот механизм подробно выяснен (Lin et al., 1996). Кроме того, экспрессия TASY может быть индуцирована SA, хотя родственный механизм остается неясным. В этом исследовании мы показали, что TcWRKY33 оказывает значительные положительные эффекты на экспрессию TASY , предполагая, что TcWRKY33 может играть важную роль в ответе TASY на SA.Как активатор TASY, TcERF15 является прямой мишенью TcWRKY33 . TcWRKY33 активирует TASY , сначала регулируя TcERF15 после индукции SA. Таким образом, TcWRKY33 передает сигналы SA к DBAT и TASY для регулирования биосинтеза таксола (Рисунок 5).

Рисунок 5 . Модель, обобщающая опосредованную TcWRKY33 регуляцию биосинтеза таксола у T. chinensis .Линии указывали на регулирование. SA и MeJA, эндогенные гормоны растений; TcWRKY33 и TcWRKY1, T. chinensis факторы транскрипции WRKY; TcERF15, T. chinensis фактор чувствительности к этилену; оранжевый пятиугольник и красный прямоугольник представляют W-боксы и GCC-бокс, цис- -элемент в промоторной области гена, соответственно; DBAT и TASY , таксадиен-синтазы.

Заключение

Мы идентифицировали SA-индуцированный активатор в биосинтезе таксола и даем ссылки на роль факторов транскрипции WRKY в регуляции биосинтеза таксола.

Заявление о доступности данных

Оригинальные материалы, представленные в исследовании, находятся в открытом доступе. Эти данные можно найти в репозитории NCBI, инвентарный номер: MW928850.

Авторские взносы

Авторы исследования —

CF, CZ и LY. YC и CZ разработали исследование. YC, HZ, MZ, WZ, ZO и ZP провели эксперименты, включая сверхэкспрессию и РНК-интерференцию TcWRKY33 , определение содержания таксанов, субклеточную локализацию, эксперимент с одним гибридом дрожжей, эксперимент с двойной люциферазой-репортером и так далее.YC и HZ проанализировали данные и написали рукопись. Все авторы прочитали и одобрили рукопись.

Финансирование

Это исследование было поддержано Фондом крупных технологических инноваций провинции Хубэй (2019ABA091). Финансирующие органы не принимали участия в разработке исследования и сбора, анализа и интерпретации данных, а также в написании рукописи, а лишь обеспечивали финансовую поддержку.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все утверждения, выраженные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают претензии их дочерних организаций или издателей, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или заявление, которое может быть сделано его производителем, не подлежат гарантии или одобрению со стороны издателя.

Благодарности

Мы благодарим за поддержку экспериментов по молекулярной биологии в основных объектах наук о жизни в Колледже науки и технологий Университета науки и технологий Хуачжун.Мы также благодарим Аналитический и испытательный центр Университета науки и технологий Хуачжун за анализ ВЭЖХ.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.697476/full#supplementary-material

Дополнительная таблица 1. Праймеры для амплификации генов, конструирования векторов и количественной ПЦР в реальном времени.

Список литературы

Абдул Рахим, Р., Ахмад, Н. Х., Аль Аззам, К. М., и Мат, И. (2018). Определение и количественная оценка содержания винбластина в пурпурных, красных и белых листьях катарантуса розового с использованием метода rp-hplc. Adv. Pharm. Бык. 8, 157–161. DOI: 10.15171 / apb.2018.019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ciolkowski, I., Wanke, D., Birkenbihl, R.P., and Somssich, I.E. (2008). Исследования селективности связывания ДНК факторами транскрипции wrky дают структурные ключи к разгадке функции wrky-домена. Plant Mol. Биол. 68, 81–92. DOI: 10.1007 / s11103-008-9353-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Крото, Р., Кетчум, Р. Э. Б., Лонг, Р. М., Каспера, Р., и Вильдунг, М. Р. (2006). Биосинтез таксола и молекулярная генетика. Phytochem. Ред. 5, 75–97. DOI: 10.1007 / s11101-005-3748-2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цуй, Ю., Мао, Р., Чен, Дж., И Го, З. (2019). Механизм регуляции факторов транскрипции семейства myc в сигнальном пути жасмоновой кислоты при биосинтезе таксола. Внутр. J. Mol. Sci. 20: 1843. DOI: 10.3390 / ijms20081843

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дуань, Ю., Цзян, Ю., Йе, С., Карим, А., Линг, З., Хе, Ю. и др. (2015). Ptrwrky73, фактор транскрипции тополя wrky, индуцируемый салициловой кислотой, участвует в устойчивости к болезням у Arabidopsis thaliana. Rep. Растительных клеток 34, 831–841. DOI: 10.1007 / s00299-015-1745-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эулгем, Т., Раштон, П. Дж., Робацек, С., и Сомсич, И. Е. (2000). Wrky суперсемейство факторов транскрипции растений. Trends Plant Sci. 5, 199–206. DOI: 10.1016 / S1360-1385 (00) 01600-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хао Х., Се К., Жуань К., Чжан Х., Ву К., Хань Б. и др. (2021 г.). Фактор транскрипции opwrky2 положительно регулирует биосинтез противоракового препарата камптотецина у ophiorrhiza pumila. Horticult. Res. 8: 7.DOI: 10.1038 / s41438-020-00437-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кан, С., Юнг, Х., Кан, Ю., Юн, Д., Бах, Дж., Янг, Ю. К. и др. (2004). Влияние метилжасмоната и салициловой кислоты на продукцию тропановых алкалоидов и экспрессию pmt и h6h в придаточных корневых культурах scopolia parviflora. Plant Sci. 166, 745–751. DOI: 10.1016 / j.plantsci.2003.11.022

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Квак, С., Чой, М., Пак, Ю., Ю, Дж., И Лю, Дж. (1995). Содержание таксола в семенах taxus spp. Фитохимия 40, 29–32. DOI: 10.1016 / 0031-9422 (95) 00247-5

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лан, А., Хуанг, Дж., Чжао, В., Пэн, Ю., Чен, З., и Кан, Д. (2013). Фактор транскрипции oswrky77 риса (oryza sativa l.), Индуцированный салициловой кислотой, участвует в устойчивости к болезням Arabidopsis thaliana. Plant Biol. 15, 452–461. DOI: 10.1111 / j.1438-8677.2012.00664.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ленка, С. К., Нимс, Н. Е., Вонгпасеут, К., Бошар, Р. А., Робертс, С. К., и Уокер, Э. Л. (2015). Чувствительная к жасмонату экспрессия генов биосинтеза паклитаксела в культивируемых клетках taxus cuspidata негативно регулируется факторами транскрипции bhlh tcjamyc1, tcjamyc2 и tcjamyc4. Фронт. Plant Sci. 6, 115. doi: 10.3389 / fpls.2015.00115

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Дж., Ван, Дж., Ван, Н., Го, X., и Гао, З. (2015). Ghwrky44, фактор транскрипции хлопка, опосредует защитные реакции на инфекцию патогена у трансгенной nicotiana benthamiana. Культ органа, ткани клеток растений. 121, 127–140. DOI: 10.1007 / s11240-014-0688-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, С., Чжан, П., Чжан, М., Фу, К., и Ю, Л. (2013). Функциональный анализ фактора транскрипции wrky, участвующего в активации транскрипции гена dbat у taxus chinensis. Plant Biol. 15, 19–26. DOI: 10.1111 / j.1438-8677.2012.00611.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лин X., Hezari, M., Koepp, A. E., Floss, H. G., and Croteau, R. (1996). Механизм таксадиен-синтазы, дитерпенциклазы, которая катализирует первую стадию биосинтеза таксола у тихоокеанского тиса. Биохимия 35, 2968–2977. DOI: 10.1021 / bi9526239

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю В., Wang, Y., Yu, L., Jiang, H., Guo, Z., Xu, H., et al. (2019). Mdwrky11 участвует в накоплении антоцианов в яблоках с красной мякотью, воздействуя на факторы транскрипции myb и фактор фотоответа mdhy5. J. Agric. Food Chem. 67, 8783–8793. DOI: 10.1021 / acs.jafc.9b02920

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мяо, З. К., Вэй, З. Дж., И Юань, Ю. Дж. (2000). Исследование влияния салициловой кислоты на биосинтез таксола. Shengwu Gongcheng Xuebao 16, 509–513.

Google Scholar

Нагата, Т., Хара, Х., Сайто, К., Кобаши, А., Кодзима, К., Юаса, Т. и др. (2012). Активация промоторов гена adp-глюкозопирофосфорилазы с помощью фактора транскрипции wrky, atwrky20, у arabidopsis thaliana l. И сладкий картофель ( ipomoea batatas lam .). Растительный продукт. Sci. 15, 10–18. DOI: 10.1626 / pps.15.10

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Плевин М. Дж., Миллс М. М. и Икура М. (2005). Мотив lxxll: многофункциональная связывающая последовательность в регуляции транскрипции. Trends Biochem. Sci. 30, 66–69. DOI: 10.1016 / j.tibs.2004.12.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Робацек, С., Сомсич, И. Э. (2001). Новый член семейства факторов транскрипции арабидопсиса wrky, atwrky6, связан как с процессами, связанными со старением, так и с защитными процессами. Plant J. 28, 123–133. DOI: 10.1046 / j.1365-313X.2001.01131.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ровинский, Э.К., Казенав, Л. А., и Донехауэр, Р. К. (1990). Таксол: новый исследуемый антимикротрубочковый агент. J. Natl. Cancer Inst. 82, 1247–1259. DOI: 10.1093 / jnci / 82.15.1247

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сан, К., Палмквист, С., Олссон, Х., Борен, М., Аландсберг, С., и Янссон, К. (2003). Новый фактор транскрипции wrky, susiba2, участвует в передаче сигналов сахара в ячмене, связываясь с чувствительными к сахару элементами промотора iso1. Растительная клетка 15, 2076–2092. DOI: 10.1105 / tpc.014597

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Суттипанта, Н., Паттанаик, С., Кулшрестха, М., Патра, Б., Сингх, С. К., и Юань, Л. (2011). Фактор транскрипции crwrky1 положительно регулирует биосинтез терпеноидных индольных алкалоидов у Catharanthus roseus. Plant Physiol. 157, 2081–2093. DOI: 10.1104 / стр.111.181834

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тунекти, Т., Эрнандес И. и Мунне-Бош С. (2013). Биосинтез салициловой кислоты и роль в модуляции метаболизма терпеноидов и флавоноидов в ответах растений на абиотический стресс . Дордрехт: Springer, 141–162. DOI: 10.1007 / 978-94-007-6428-6_8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уокер К. и Крото Р. (2000). Молекулярное клонирование кДНК 10-деацетилбаккатин iii-10-о-ацетилтрансферазы из taxus и функциональная экспрессия в escherichia coli. Proc. Natl.Акад. Sci. США 97, 583–587. DOI: 10.1073 / pnas.97.2.583

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wang, F., Hou, X., Tang, J., Wang, Z., Wang, S., Jiang, F., et al. (2012). Новый индуцируемый холода ген из pak-choi ( Brassica campestris ssp. Chinensis), bcwrky46, повышает устойчивость трансгенного табака к холоду, соли и стрессу от дегидратации. Мол. Биол. Rep. 39, 4553–4564. DOI: 10.1007 / s11033-011-1245-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, X., Guo, R., Tu, M., Wang, D., Guo, C., Wan, R., et al. (2017). Эктопическая экспрессия фактора транскрипции дикого винограда wrky vqwrky52 в Arabidopsis thaliana повышает устойчивость к биотрофному патогену мучнистой росы, но не к некротрофному патогену botrytis cinerea. Фронт. Plant Sci. 8:97. DOI: 10.3389 / fpls.2017.00097

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, Ю., Ву, Дж., И Юань, Ю. (2007). Продукция таксола, индуцированная салициловой кислотой, и биосинтез изопентенилпирофосфата в суспензионных культурах taxus chinensis var. Mairei. Cell Biol. Int. 31, 1179–1183. DOI: 10.1016 / j.cellbi.2007.03.038

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вани, М. К., Тейлор, Х. Л., Уолл, М. Э., Коггон, П., и Макфейл, А. Т. (1971). Растительные противоопухолевые средства. Vi. Выделение и структура таксола, нового противолейкозного и противоопухолевого агента от Taxus brevifolia. J. Am. Chem. Soc . 93, 2325–2327. DOI: 10.1021 / ja00738a045

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Юкимунэ, Ю., Табата, Х., Хигаши, Ю., и Хара, Ю. (1996). Метилжасмонат-индуцированная гиперпродукция паклитаксела и баккатина III в суспензионных культурах клеток таксуса. Нат. Biotechnol. 14, 1129–1132. DOI: 10.1038 / nbt0996-1129

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhang, L., Chen, C., Xie, F., Hua, Q., Zhang, Z., Zhang, R., et al. (2021 г.). Новый фактор транскрипции wrky hmowrky40, связанный с биосинтезом беталаина у питайи (hylocereus monacanthus) посредством регуляции hmocyp76ad1. Внутр. J. Mol. Sci. 22: 2171. DOI: 10.3390 / ijms22042171

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhang, M., Chen, Y., Nie, L., Jin, X., Liao, W., Zhao, S., et al. (2018a). Транскриптомная идентификация и скрининг сомнительных факторов, участвующих в регуляции биосинтеза таксола у taxus chinensis. Sci. Rep. 8: 5197. DOI: 10.1038 / s41598-018-23558-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан, М., Jin, X., Chen, Y., Wei, M., Liao, W., Zhao, S., et al. (2018b). Tcmyc2a, основной фактор транскрипции спираль-петля-спираль, трансдуцирует ja-сигналы и регулирует биосинтез таксола у taxus chinensis. Фронт. Plant Sci. 9: 863. DOI: 10.3389 / fpls.2018.00863

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhang, M., Li, S., Nie, L., Chen, Q., Xu, X., Yu, L., et al. (2015). Два фактора, чувствительных к жасмонату, tcerf12 и tcerf15, соответственно, действуют как репрессор и активатор гена tasy биосинтеза таксола у taxus chinensis. Plant Mol. Биол. 89, 463–473. DOI: 10.1007 / s11103-015-0382-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhang, S., Li, C., Wang, R., Chen, Y., Shu, S., Huang, R., et al. (2017). Митохондриальная протеаза арабидопсиса ftsh5 участвует в старении листьев посредством регуляции Wrky-зависимого накопления салициловой кислоты и передачи сигналов. Plant Physiol. 173, 2294–2307. DOI: 10.1104 / стр. 16.00008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжэн, З., Камар, С.А., Чен, З., и Менгисте, Т. (2006). Фактор транскрипции Arabidopsis wrky33 необходим для устойчивости к некротрофным грибковым патогенам. Plant J. Cell Mol. Биол. 48, 592–605. DOI: 10.1111 / j.1365-313X.2006.02901.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ролевых интеллектуальных существ в D&D 5e, P2: Hyper-Intelligence

Для начала, для этого поста я в значительной степени опирался на концепции проекта Orion’s Arm Universe Project, совместной научно-фантастической онлайн-программы по построению мира.Хотя у них есть несколько чрезвычайно сложных шкал интеллекта, я для начала позаимствую три простые категории при обсуждении темы Hyper-Intelligence :
1. Non-Sapient , INT 1-5 в моем индексировании 5e, особенности « познание, ощущение, эмоция ».
2. Разумный , INT 6-19 в моей индексации 5e, особенности «самосознания, языка, рациональности, абстрактности, умения считать».
3. Transapient , INT 20-29 в моем индексировании 5e, функции «предвидение, надзор, идеогенез, транслогия, аутонаука»

Я скоро расскажу, что все это значит.А пока напомним, что в первой части я выделил четырнадцать архетипов интеллекта для D&D 5e: архитектор, художник, историк, изобретатель, исследователь, лингвист, логик, натуралист, математик, философ, мудрец, стратег, ремесленник и провидец. Давайте начнем объединять все это в последовательную последовательность, включая поведенческие черты, архетипы интеллекта и стратегии по уровням, показывая реальные примеры существ D&D 5e.

( Примечание : примите эти рекомендации как необязательные правила, которые, безусловно, повлияют на рейтинг испытаний монстров, как я уже упоминал в своей статье, Рейтинг испытания Beyond D&D 5e: 20 черт сложности, опасности и смерти.)

Оценка интеллекта 14-15: Одаренные

Пример D&D 5e Creatures : Улыбающийся Облачный Гигант, Смертельный блок, Джинни, Эриний, Чудесный дракон, Гауф, Хобгоблин-военачальник, Они, Священная статуя, Спрайт, Рой черепных крыс, Юань-Ти Малисон .

На этом уровне существа начинают действовать немного более эксцентрично, возможно, с идиосинкразическими речевыми моделями или с умным использованием иронии. Иногда они могут делать твердые выводы, основываясь на многих, казалось бы, не связанных деталях.Иногда у одаренных могут появиться проблески понимания новых систем, которые они могут найти с пользой, имея сильную рабочую память. Примечательно, что существа этого интеллектуального уровня могут начать попытки простой передачи навыков, заполняя пробелы в навыках, полагаясь на остроумие. Например, использование военной хитрости вместо сырого Обман , повторение точных физических инструкций вместо сырого Ловкость рук или достижение Запугивание с помощью интеллектуальных игр. Наконец, они могут отображать фоновую многозадачность для более умеренных задач — но несколько неэффективно — не требуя внимания.Например, медленно рисовать простые математические доказательства и одновременно вести беседу, не имеющую отношения к делу.

Рассмотрим способы, которыми Swarm of Cranium Rats может преодолеть препятствие более необычно, изобретательность Hobgoblin Warlord в битве превращается в политические маневры, Yuan-Ti Malison уделяет внимание тонким деталям и дает ответы на них. Или ирония Faerie Dragon’s . Или как Gauth может подсознательно переставить себя для приближающейся агонии.Эти Одаренные существа овладевают Архетипом Интеллекта . Подумайте об компетентных Sprite Naturalist, Oni Tradecrafter, Djinni Mathematician.

Пример боевого подхода для одаренных: гамбит, основанный на засаде и финтах.

Оценка интеллекта 1 6 -1 7 : Genius

Пример D&D 5e Creatures : Андросфинкс, Бехолдер, Дева, Мать-дроу, Эфрити, Ночная Ведьма, Штормовой Гигант, Вампир, Молодой Зеленый Дракон .

На этом уровне существа развивают произвольную мнемонику, то есть лингвистические техники или методы визуализации, которые улучшают запоминание с помощью методов воображения, ассоциаций или определения местоположения, которые могут высвободить рабочую память и улучшить память. Например, классическая фраза «Рой Г. Бив», чтобы напомнить порядок цветов радуги (красный, оранжевый, зеленый, синий, индиго, фиолетовый). Это также может включать полезные сокращения и изречения или сопоставление несвязанных имен с пространствами в пределах визуализации навигации.Кроме того, они могут продемонстрировать блестящее понимание индукции и формальной логики, а также сильный рефлекс на аналогии, сравнения и метафоры. И связанный с этим аспект, способность Genius к сложному моделированию, позволяет улучшить прогнозирование вероятностей. Теперь, вместо случайной вспышки озарения, поведение этих существ меняется в сторону повторяющегося вдохновения, часто придумывая новые техники. Благодаря этому они развивают уникальные личности.

Что касается памяти, они переживают очень подробные воспоминания Flashbulb, вспоминая моменты шокирующих и важных новостей в более ярких деталях, не просто «снимках», а как в значительной степени последовательные расширенные воспоминания.На этом уровне существа также экспериментируют со сложной передачей навыков, возможно, используя свои знания History для выборки шаблонов из известных речей для использования в социальных проверках или используя Investigation для сбора информации о поведении животных для Animal Handling . Обладая улучшенными способностями к запоминанию с помощью таких функций, как мнемоника или визуализация, они иногда достигают минимально функционального многодорожечного мышления, что означает, что иногда они могут наложить простую мысль, такую ​​как мантра запоминания или мысленное видео, внутри большего внимания к более сложным. и увлекательный ход мыслей, скажем, объясняющий не относящуюся к делу тему.

Какие умственные ярлыки мог бы использовать Beholder в своем устрашающем аналитическом подходе? Подумайте, как способность Androsphinx разгадывать загадки зависит от его понимания логики и техники повествования. Представьте себе яркую хронику воспоминаний вампиров годов, ее хищные предсказания. Или хитрая Матрона-Мать дроу , использующая свое умение Религия для древнего обряда, который создает орудие физического воздействия. Эти гениальные создания могут овладеть вторым архетипом интеллекта или овладеть существующим.Подумайте об искусном Deva Artist, Storm Giant Visionary или Efreeti Philosopher.

Пример боевого подхода для Genius: гамбит, основанный на наборе рекурсивно улучшающихся базовых начальных ходов, таких как шахматные открытия.

Оценка интеллекта 18-19: Prodigy

Пример D&D 5e Creatures : Взрослый Облекс, Древний Бронзовый Дракон, Тиран Смерти, Гизерай Анарх, Гиносфинкс, Марилит, Марид, Марут, Ловец разума, Планета, Зимний Эладрин .

Существа этого уровня начинают достигать порога Гиперинтеллекта. Они могут разработать практическую мнемонику, в которой сам мнемонический механизм становится практическим, а не произвольным. Например, они могут вписать термины для запоминания в физические распорядки, которые требуют большого количества задач, но небольшого определенного порядка, например, различные задачи по уборке, что позволяет достичь запланированной многогранной продуктивности, как умственной, так и физической одновременно. Они также часто демонстрируют сверхъестественную способность делать точные выводы, используя минимальное количество связанных деталей.Точно так же способность Prodigy к сублитизации, то есть количество объектов, которые они могут сразу сгруппировать для подсчета или оценки, значительно возрастает по сравнению с обычным диапазоном 2-5 элементов за один раз. Кроме того, они демонстрируют постоянное вдохновение в новых процессах, а также невероятную широту хранимой памяти. В целом, существа этого уровня становятся потрясающе проворными и методичными учениками. Они могут надежно различать огромное количество альтернатив в решении проблем, запоминать длинные списки в короткие промежутки времени и довольно эффективно использовать активную последовательную многозадачность, преодолевая нормальный лимит в 5-9 элементов в рабочей памяти.

Представьте себе продуктивные мнемонические процедуры, которые Marilith может развить, используя все семь конечностей, или точно так же стебельков Death Tyrant. Marut , как исполнитель космического закона, вероятно, находит хорошее применение своим мощным бухгалтерским способностям. Adult Oblex поглотил столько воспоминаний, что стал в некотором смысле живой энциклопедией. Mind Flayer , возможно, добывает мозг, который он пожирает, для освоения новых методологий. А Githzerai Anarch манипулирует материей с научной точностью, постоянно экспериментируя и перенастраивая свое псионическое терраформирование.Эти существа-вундеркинды могут обладать несколькими умениями архетипа интеллекта или добавлять новое умение к уже освоенному. Подумайте о Gynosphinx , мастере-логике и начинающем лингвисте. Planetar Исследователь, мудрец и стратег. Winter Eladrin Мастер Художник и молодой Историк.

Пример боевого подхода для Prodigy: гамбит, основанный на дальнейших шахматных маневрах, таких как булавки (обездвиживание защитника противника) или вилки и шампуры (одновременная угроза нескольким врагам, чтобы принести жертву).

Интеллект 20–21: вдохновитель

Example D&D 5e Creatures : Ancient Copper Dragon, Balor, Elder Brain, Empyrean, Lich .

На этом уровне существа достигают собственно Гиперинтеллекта, демонстрируя «Транспиентное» поведение. Начнем с того, что их эховая (слуховая) память функционирует больше как иконическая (визуальная) память нижних уровней, с возможностью вспоминать, воспроизводить и зацикливать звуки. Скорее всего, они обладают аудиографической памятью, отличной голосовой памятью, способной мгновенно воспроизводить звуки, которые они слышали только однажды.Их умы могут пассивно делать больше, чем большинство из них когда-либо могут достичь активно, в том числе запускать алгоритмы условной вероятности без активного контроля. Да, Mastermind живет в состоянии повторяющегося вдохновения, созерцая и разрабатывая целые системы. Иногда это достигает идеогенеза или непрерывного творчества без промежуточных шагов или периодов ухода.

И вместо просто широкой памяти, у них также есть эффективная память с быстрым запоминанием и повышенной умственной инициативой.Их рабочая память обладает удивительной способностью эффективно выполнять несколько задач одновременно в фоновом режиме, в то время как они концентрируются на главном. И это также может включать использование синестезии, когда одна сенсорная или когнитивная стимуляция запускает другую одновременно, для их обучения. Из-за этого их умы более сложными способами справляются с пространственным мышлением, таким как размерность, ориентация и движение, и более плавно включают множественные сенсорные входы в визуализации и воспоминания.

Представьте, что Elder Brain требует многозадачности, чтобы быстро уравновесить свой телепатический центр, психическую связь и функции восприятия мыслей, а также мозговой штурм, который может возникнуть в результате этого. Созерцайте ужасающего Balor , действующего в качестве генерала армии демонов, поскольку он использует сложное пространственное мышление для наблюдения за полем битвы. Представьте, что Lich зацикливает старые разговоры, просеивает и анализирует их на огромных промежутках времени, одновременно управляя рукописями.Разве Древний Медный Дракон не может периодически покидать свой холм в течение своих долгих лет, чтобы изменить форму для межвидового Синестетического обучения? Эти существа-вдохновители развивают двойной Интеллект Архетип Мастерства или владеют множеством умений. Поразмышляйте над Empyrean, , мастером-изобретателем и провидцем, Lich, , мастером-историком и мудрецом, Elder Brain , уравновешивающими роли архитектора, исследователя, лингвиста, философа и стратега одновременно.

Пример боевого подхода для Mastermind: Batman Gambit, маневр, требующий твердой информации и умелого планирования, который зависит от точного предсказания поведения врага. Работает, если все остаются верными своему характеру!

Интеллект 22–23: Психометр

Пример D&D 5e Creatures : Elder Oblex, Kraken, Nagpa, Pit Fiend .

На этом уровне образ мыслей существ приобретает более мистический характер в глазах существ более низкого уровня.Чтобы проиллюстрировать, они могут искусно говорить с патафорами, используя расширенные метафоры, которые расходятся с метафорической реальностью в той же степени, в какой нормальные метафоры расходятся с нефигуративным языком. Это может функционировать как вложенные метафоры, которые работают на нескольких уровнях, и упаковывать в них более мелкие метафоры. Они также могут делать впечатляющие выводы даже из минимального количества не связанных между собой деталей. Эти существа обладают мощным рефлексом бокового мышления и могут оптимизировать конструкции на основе собственных уникальных инструментов системного анализа.Психометры также демонстрируют эйдетическую память, хотя и неэффективную, способную медленно вспоминать даже тривиальные воспоминания с помощью фотографий. Они могут применяться для различных эффектов остаточного остаточного изображения или в качестве прайминга изображений для стимуляции созерцания. В противном случае они демонстрируют резко ускоренное рассуждение. Точно так же, как более низкие уровни могут испытывать прозрения и приступы творчества, Психометры иногда достигают непостоянного вида параллельного фокуса, одновременно выполняя аналогичные большие потоки мыслей.

Эти Психометры достигли тройного мастерства в Архетипах Интеллекта , или же стали мастером на все руки. Представьте себе сложные маневры дьявольских легионов под командованием генерала Pit Fiend , способного быстро разрабатывать стратегию, а иногда и при совместной координации батальонов, опытного лингвиста, стратега и торговца. То, как заговорщица Нагпа использует свое базовое Боковое Мышление и оптимизированный анализ и применение Патафор для раскрутки сюжетов и марионеточного мастерства, равно как мастера-исследователя, мудреца и ремесленника.То, как Elder Oblex терпеливо накапливает свою Эйдетическую Память, поглощая сознание и улучшая олицетворения 2d6 + 1, которые он культивирует, в различные умения Архетипа Интеллекта. Как Kraken , эта древняя сила природы, перемалывает пророческую информацию эоны, моделируя и совершенствуя бесчисленные боевые приемы в своем уме, пока он ждет катализатора, призыва разрушить мир, историк, логик и стратег все в одном.

Пример боевого подхода для Психометра: использование персонализированного военного руководства с кодифицированной стратегией, например The Art of War или Thirty-Six Strategems .

Интеллект 24–25: параллельный гиперразум

Пример D&D 5e Creatures : Sibriex, Solar, Titivilus .

На этом уровне существа достигают вершины сложности, возможной с существующей ментальной архитектурой более низких уровней. Они могут совершать экстраординарные подвиги, такие как одновременное голосовое и невербальное общение, передавая потенциально несвязанные сообщения. Их подсознание может выполнять сложные математические функции, а их сознание может выполнять вычисления, которые кажутся непонятными существам более низкого уровня.Способности этих существ к самосознанию и саморефлексии достигают уровня самообучения или понимания, в котором они могут прозрачно наблюдать свои собственные ментальные структуры и процессы. Параллельные гиперразумы испытывают почти непрерывные прозрения и повторяющийся идеогенез. И их память невероятно широка, вращаясь, как огромный Rolodex, который может эффективно вызывать в воображении полезные ретрокогнитивные ретроспективные кадры. Не только это, но и их способность к обработке и обучению демонстрирует Надзор, указывая на процедурную осведомленность, которая может обнаруживать закономерности в кажущихся несвязанными или случайных данных, воспринимая свойства и связи необычайной сложности.Это сочетается со стабильным параллельным фокусом, позволяя активную работу нескольких цепочек мыслей в тандеме.

Эти параллельные гиперразумы становятся эрудитами, смешивая различные архетипы интеллекта вместе и сохраняя при этом не что иное, как мастерство. Представьте себе Solar , сидящего в созерцательном вычислении, порождающего прозрения до тех пор, пока его не призывают в качестве божественного посланника, овладевшего среди прочих ролями лингвиста, логика, математика и стратега.Представьте себе интеллект, необходимый для Titivulus , чтобы манипулировать и перехитрить архидьявола Dispater , плести заговоры и разыгрывать силы, проецировать чревовещание и обрабатывать реалистичные воспоминания, частично историк, частично философ, частично торговец, частично провидец. Или Sibriex , этот древний оскверняющий ужас, непрерывно расширяющий программы разведения демонов, накапливая запретные знания внутри своего чудовищно могущественного разума, овладев, по крайней мере, аспектами Архитектора, Изобретателя, Мудреца и Провидца.

Пример боевой подход для Parallel Hypermind: Xanatos Gambit, план, в котором они ожидают и извлекают выгоду из всех предсказуемых результатов, даже очевидных неудач.

Интеллект 26-27: полиморфный метамозг

Пример D&D 5e Creatures : Fraz-Urb’luu, Zariel .

Существа этого уровня обладают непостижимым интеллектом. В рамках своего мировоззрения они могут формировать аватары ментальности, которые позволяют им сочувствовать и эффективно общаться с существами с более низким интеллектом.И они могут концептуализировать мета-токены, которые точно описывают любую концепцию, которую может вообразить Нетранспиент (INT 1-19), сравнимо с тем, как разумные существа могут сформулировать вкус маринада бедным язычникам, у которых его никогда не было. Более того, их способность к предвидению удерживает все более точные, сложные и тонкие уровни предвосхищения, начиная понимать «транслогию», такой же большой скачок по сравнению с традиционной логикой, как квантовая механика к ньютоновской физике или неевклидова геометрия к евклидовой геометрии.Мастер краткости, Полиморфный Метамозг часто может сформулировать инструкции в терминах Колмогоровской Сложности, как видно из примера навигационных указаний XKCD: «… поверните все налево, чтобы не попасть на шоссе с простым номером или улицу, названную в честь президента ». . Совершенно другая форма концептуализации. И они могут выразить это в манере, эмоционально подавляющей менее разумные существа. Слова, которые звучат пророчески.

Еще раз повторю, что у них не параллелизм и широта ума, а полиморфная структура разума, содержащая сложный нелинейный формат чрезвычайной глубины.Это несет в себе не только вечный идеогенез, но и мета-визуализацию, способность преднамеренно проецировать концептуализации на переживаемую реальность аналогично дополненной реальности. Чрезвычайная глубина их многомерной памяти указывает на многогранность, фрактальность. Что это обозначает? Это означает, что они изначально хранят полные ментальные модели объектов или сред с ветвящимися уровнями сложности, способные плавно переходить между доступом, например, к видимому представлению объекта, схематическому представлению объекта или оцененному представлению объекта. все они индексируются в последовательную иерархию, сопоставимую с веб-страницей.Благодаря этому они обладают самочувствием, способностью кропотливо реформировать свои собственные когнитивные структуры. И эта преднамеренность позволяет создать тип нейронной сети, который еще больше значительно улучшает рабочую память.

Пока что в D&D 5e только два небожества достигли этого порога: Fraz-Urb’luu и Zariel . Эти полиморфные метамиды становятся почти непостижимыми в их слиянии и овладении различными архетипами интеллекта . Фраз-Урб’луу , Князь Обмана и Повелитель Демонов иллюзий, который любит обманывать и развращать охотников на демонов. Представьте себе иллюзии, которые он может творить, используя аватары ментальности и мета-жетоны, соблазняя зловещими ярлыками Колмогорова, а затем сбивая с толку паутиной пророческой транслогии, постоянно изменяя схему своего разума, чтобы избежать проверки и отслеживать бесчисленные уровни обмана. Для начала, его области «Художник и философ», «Математик и мудрец», «Торговец» и «Визионер» станут легендарными.А затем Зариэль , падший ангел и архидьявол, возвышающийся над Авернусом, тем проходом в Девять Адов, где яростно бушует Кровавая Война. Представьте себе, как она, видевшая и Небеса, и Ад, должна использовать свое предвидение, чтобы предвидеть вторжения демонов, или свою Транслогию, чтобы бороться даже с такими, как Asmodeus . Как ее многогранный разум изучает море душ, с которыми можно торговаться, вербовать достойных в качестве воинов. Ее образы историка, изобретателя и логика, не говоря уже о лингвисте и стратеге, должны сиять.

Пример боевого подхода для Полиморфного Метамозга: Xanatos Speed ​​Chess, как и в предыдущем Гамбите Xanatos, но с использованием постоянных изменений и улучшений для учета вновь возникающих условий.

Интеллект 28-29: Гештальт-коллективный разум

Пример D&D 5e Creatures : ничего не написано.

Существа с таким уровнем умственной остроты просто вышли из списка. Можно только догадываться о природе умов таких божеств и полубогов.Тем не менее, у нас есть указания от тех, кто взаимодействовал с такими сущностями, что они, вероятно, обладают панлингвизмом, а также изменчивой формой всеведения, предсказывая кажущееся будущее с приличной точностью в редкие моменты вдохновения. Их образ мышления может работать на уровне квантовых вычислений, который больше не ограничивается смертной логикой. Слухи предполагают, что эти сущности могут даже представить функциональные реальности в более сложных деталях, чем они есть на самом деле, полностью моделируя их в своем сознании.И, как вам скажет любой Elf или Dwarf , эти существа действуют как живые культурные прародители, потенциально пробуждая вид в новую эру вознесения. Возможно, они улучшают сознание вида, увеличивая его способности к обучению и памяти.

Также интересно, действительно ли они достигли Панмнезии, полного воспоминания всех своих мыслей, чувств и взаимодействий. Спорно, возможно, более разумно рассматривать их как коллективы, а не как индивидуумов, ибо что еще составляет аватаров, которых они могут отправлять в мир? Такая теория также указала бы на возможность создания сетевых аватаров для этих гештальт-коллективов и, таким образом, на оптимизацию всех способов индексации и оценки.Подводя итог этому, очевидная уверенность богов в смертных может предполагать, что их понимание превосходит даже их свободу воли. Но помимо всего этого, какие силы они хранят в себе, мы, возможно, никогда не узнаем. И эти сущности, казалось бы, полностью превосходят архетип.

Пример боевой подход для гештальт-коллективного разума: не что иное, как материал Чудес — Wish или Божественное вмешательство . Поистине материал Гнева!

Разработка метода микроэкстракции с использованием вихревой ионной жидкости для определения ароматических аминов в пробах воды из окружающей среды

Разработка метода микроэкстракции с использованием вихревой ионной жидкости для определения ароматических аминов в пробах воды окружающей среды

Метод микроэкстракции с использованием вихревой ионной жидкости в сочетании со сверхбыстрым жидкостным хроматографическим разделением и детектированием был разработан для анализа трех ароматических аминов, 4-хлоранилина, 1-нафтиламина и 4-аминобифенила в пробах воды из окружающей среды.Гексафторфосфат 1-гексил-3-метилимидазолия [C ₆ MIM] [PF ₆ ] использовали в качестве экстракционного растворителя, поскольку он может полностью и быстро диспергироваться в воде с помощью перемешивания вихревым движением. Диспергирующий растворитель не требовался. Были исследованы несколько параметров, таких как тип и объем экстракционного растворителя, скорость завихрения, время экстракции, время центрифугирования, pH раствора образца и ионная сила в растворе образца. В оптимизированных условиях суточная и межсуточная точность предложенного метода составила 2.3–3,5% ( n = 5) и 2,8–5,3% ( n = 5) соответственно. Пределы обнаружения и количественного определения находились в диапазоне 0,24–0,57 мкг л ^–1 и 0,80–1,90 мкг л ^–1 соответственно. Предложенный метод применен при определении трех ароматических аминов в нескольких реальных пробах воды. Были получены приемлемые степени извлечения аналитов от 79% до 111% (относительные стандартные отклонения ≤6,0%).

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

Оценка чувствительности и специфичности технологии CanPatrol ™ для обнаружения циркулирующих опухолевых клеток у пациентов с немелкоклеточным раком легкого

ЦОК относятся к опухолевым клеткам, попадающим в периферическую кровь первичными опухолями и / или метастатическими поражениями.Потому что ЦКО играют важную роль в образовании метастазов и в значительной степени участвуют в смертях, связанных с опухолями. Следовательно, обнаружение ЦКО в периферической крови важно для ранней диагностики, а также для оценки эффективности и прогноза [8,9,10, 16]. Однако из-за очень ограниченного количества ЦКО в периферическом кровообращении, неоднородности подтипов ЦКО, а также легкости агрегации в микропробки и т. Д. Чувствительность, специфичность и эффективность технологии обнаружения ЦКО чрезвычайно сомнительны [17].

Ключевыми этапами обнаружения ЦКО являются обогащение и идентификация. В настоящее время ЦОК отделяют от других клеток крови в основном по физическим характеристикам (таким как размер, плотность, заряжаемость и деформируемость ЦКО и т. Д.) И биологическим характеристикам (например, по антигену клеточной поверхности) [18]. Сортировка ЦОК по физическим характеристикам проста в эксплуатации и относительно невысока, но не может избежать влияния индивидуальной неоднородности, в то время как сортировка ЦОК по биологическим характеристикам обеспечивает точность, но ограничена типами антигена, экспрессируемого на поверхности клетки.Методы идентификации ЦКО включают подсчет клеток, основанный на проточной цитометрии, и обнаружение нуклеиновых кислот, основанное на цепной реакции обратной транскриптазы и полимеразы. Метод подсчета клеток может количественно определять количество ЦКО и анализировать различные параметры ЦКО (такие как размер, морфология, внутриклеточные и внеклеточные биомаркеры, а также геномные мутации), но чувствительность обнаружения низкая и требует большого объема образец крови; Преимущества метода обнаружения нуклеиновых кислот заключаются в экономии времени, высокой специфичности и необходимости меньшего количества образцов крови, но этот процесс неизбежно разрушает морфологию и функцию клеток, делая дальнейший анализ невозможным.Кроме того, из-за легкой деградации мРНК и влияния неспецифической амплификации увеличивается частота ложноположительных результатов [18,19,20,21]. Система CellSearch в настоящее время широко известна и используется для обнаружения ЦКО рака легких, которая состоит в основном из автоматизированных систем иммуномагнитного разделения и систем иммунофлуоресцентного анализа. ЦОК выделяются и обогащаются на основе экспрессии EpCAM, но мезенхимальные ЦОК, которые претерпели эпителиально-мезенхимальную трансформацию, не могут быть обнаружены [8].Поэтому в настоящее время не существует идеального метода обнаружения ЦКО в периферической крови пациентов с НМРЛ.

Технология CanPatrol ™, использованная в этом исследовании, объединила технологию наномембранной фильтрации и множественные методы анализа РНК in situ для сортировки и идентификации ЦОК. Технология обнаружения ЦКО Canpatrol ™ (Canpatrol ™, Surexam) эффективно преодолевает ограничения, связанные с выделением только определенного эпителиального фенотипа ЦОК и отсутствием обнаружения кластеров лейкоцитов-ЦКО клеток. ЦКО удерживаются с помощью фильтрации через наномембрану и анализируются на конкретные гены с помощью высокочувствительного анализа множественной РНК in situ (MRIA).Достигнута точная классификация ЦОК периферической крови человека. Он содержит пять типов, включая эпителиальные ЦОК, мезенхимальные ЦОК, эпителиально-мезенхимальные ЦОК, кластерные ЦОК и кластеры лейкоцитов-ЦКО. Мы использовали наномембрану с самооптимизирующимся размером пор 8 мкм для фильтрации периферической крови, так что опухолевые клетки в периферической крови были сильно обогащены. Предыдущие исследования показали, что степень обогащения достигает 89%, а степень удаления лейкоцитов достигает 99,98% [22]. Преимущество этого метода заключается в том, что он может полностью отсортировать все типы ЦКО (эпителиальные, эпителиально-мезенхимальные и мезенхимальные ЦКО), не полагаясь на конкретные биомаркеры, и может применяться для обогащения большинства ЦКО солидных опухолей [15].Кроме того, Canpatrol ™ использует новый метод анализа множественных мРНК in situ для гибридизации конкретных зондов с целевым геном и дальнейшего повышения чувствительности и специфичности обнаружения с помощью системы каскадной амплификации флуоресцентного сигнала. В этом исследовании мы сравнили ЦОК в периферической крови пациентов с НМРЛ и доброкачественными заболеваниями легких. Статистический анализ показал, что существуют различия в количестве трех подтипов ЦКО и общем количестве ЦКО между двумя группами. Анализ кривой ROC показал, что чувствительность и специфичность технологии CanPatrol ™ для обнаружения ЦКО периферической крови при НМРЛ составляет 81.6 и 86,8% соответственно. Можно сделать вывод, что этот метод имеет лучшую диагностическую точность для НМРЛ и имеет очевидные диагностические преимущества по сравнению с другими методами. Кроме того, в качестве неспецифической технологии физического обогащения Canpatrol ™ уменьшает повреждение опухолевых клеток в периферической крови, сохраняя исходную клеточную информацию, такую ​​как морфология, функция клеток, информация о молекулярной биологии и т. Д. Таким образом, технология Canpatrol ™ полезна для последующих иммунофлуоресценция, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), экспрессия генов, обнаружение генных мутаций и анализ секвенирования одноклеточных ЦОК на основе микродиссекции.Более того, эту технологию также можно использовать для клеточных культур и животных моделей для разработки новых лекарств и проведения испытаний на лекарственную чувствительность, которые будут всесторонне и динамически раскрывать молекулярную информацию опухоли и направлять индивидуализированное лечение онкологических больных.

В этом исследовании не было статистически значимой разницы в количестве ЦКО между аденокарциномой легкого, плоскоклеточным раком легкого и другими НМРЛ, что согласуется с предыдущими исследованиями [23, 24].CTC в основном предназначен для прогнозирования риска рецидива и метастазирования, а также для оценки эффективности. Корреляции с патологическим типом не так много. Этот вывод согласуется с другими исследованиями [25, 26]. Что касается того, есть ли разница, потому что количества случаев недостаточно для получения точного заключения, необходимы дополнительные исследования, чтобы подтвердить корреляцию между стадией и ЦОК. Статистической разницы в количестве ЦОК подтипа и общем количестве ЦОК между разными возрастами (≥60 лет или> 60 лет) не было, что указывает на то, что возраст не является фактором, влияющим на ЦКО, и наш результат согласуется с предыдущими исследованиями [23, 24, 27].Посредством регрессионного анализа пропорциональных рисков COX данных последующего наблюдения мы обнаружили, что патологическая стадия является фактором риска рецидива и метастазирования, что указывает на то, что более научным является построение кривой выживаемости после скрининга риска и стратификации.

No related posts.